Биосфера
<<  Тенденции развития биологического образования в современных условиях Универсальный язык для визуального моделирования биологических систем  >>
Электронный Парамагнитный Резонанс и его применение в
Электронный Парамагнитный Резонанс и его применение в
Электронный Парамагнитный Резонанс
Электронный Парамагнитный Резонанс
Электронный парамагнитный резонанс
Электронный парамагнитный резонанс
Взаимосвязь механического и магнитного моментов
Взаимосвязь механического и магнитного моментов
Суммарный магнитный момент
Суммарный магнитный момент
Энергия электрона в магнитном поле
Энергия электрона в магнитном поле
Ориентация электронных спинов в магнитном поле
Ориентация электронных спинов в магнитном поле
H
H
E = hn
E = hn
Почему ЭПР можно наблюдать только у парамагнетиков
Почему ЭПР можно наблюдать только у парамагнетиков
История открытия явления ЭПР
История открытия явления ЭПР
ЭПР спектрометр
ЭПР спектрометр
В Казанском ГУ
В Казанском ГУ
Прибор Завойского для измерения ЯМР и ЭПР
Прибор Завойского для измерения ЯМР и ЭПР
Прибор Завойского для измерения ЭПР
Прибор Завойского для измерения ЭПР
Как получить сигнал ЭПР
Как получить сигнал ЭПР
Что такое сигнал ЭПР
Что такое сигнал ЭПР
Электронный Парамагнитный Резонанс
Электронный Парамагнитный Резонанс
Примеры сигналов ЭПР
Примеры сигналов ЭПР
Основные характеристики сигнала ЭПР
Основные характеристики сигнала ЭПР
C = Cs(S / SS)
C = Cs(S / SS)
Ширина сигнала ЭПР
Ширина сигнала ЭПР
Время релаксации
Время релаксации
Малое T Большое DH
Малое T Большое DH
R1
R1
G-фактор
G-фактор
Сверхтонкое взаимодействие
Сверхтонкое взаимодействие
Сверхтонкая структура
Сверхтонкая структура
Сверхтонкое взаимодействие (продолжение)
Сверхтонкое взаимодействие (продолжение)
Электронный Парамагнитный Резонанс
Электронный Парамагнитный Резонанс
Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:
Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:
Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:
Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:
Спектр ЭПР печени крысы
Спектр ЭПР печени крысы
Радикал аскорбата
Радикал аскорбата
Естественные сигналы ЭПР, наблюдаемые в биологических системах
Естественные сигналы ЭПР, наблюдаемые в биологических системах
Сигналы ЭПР семихинонных или феноксильных радикалов
Сигналы ЭПР семихинонных или феноксильных радикалов
Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:
Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:
Метод спиновых зондов
Метод спиновых зондов
Cпектр ЭПР ТЕМПО при разных tс
Cпектр ЭПР ТЕМПО при разных tс
Время корреляции нитроксильного радикала непосредственно связано с
Время корреляции нитроксильного радикала непосредственно связано с
Параметр гидрофобности f
Параметр гидрофобности f
Спектр ЭПР спинового зонда 5-доксил стеарата в мембране эритроцита
Спектр ЭПР спинового зонда 5-доксил стеарата в мембране эритроцита
Параметр упорядоченности и вязкость мембраны
Параметр упорядоченности и вязкость мембраны
Изменения сигнала ЭПР при уменьшении S и возрастании угла отклонения
Изменения сигнала ЭПР при уменьшении S и возрастании угла отклонения
Изменения сигнала ЭПР при удалении нитроксильного радикала от полярной
Изменения сигнала ЭПР при удалении нитроксильного радикала от полярной
Cпектр ЭПР рН чувствительного зонда (pK=4,7) при разных рН
Cпектр ЭПР рН чувствительного зонда (pK=4,7) при разных рН
Зависимость параметра f и aN от рН
Зависимость параметра f и aN от рН
Спектр ЭПР химотрипсина с присоединенной спиновой меткой
Спектр ЭПР химотрипсина с присоединенной спиновой меткой
Белок
Белок
Сигнал ЭПР спиновой метки в гемоглобине
Сигнал ЭПР спиновой метки в гемоглобине
Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:
Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:
R• + ST
R• + ST
Характеристики спектра ЭПР спиновых аддуктов
Характеристики спектра ЭПР спиновых аддуктов
Основные виды спиновых ловушек
Основные виды спиновых ловушек
Основные требования к спиновым ловушкам
Основные требования к спиновым ловушкам
Кинетические и спектральные характеристики спиновых аддуктов
Кинетические и спектральные характеристики спиновых аддуктов
Идентификация радикалов по спектрам ЭПР спиновых аддуктов
Идентификация радикалов по спектрам ЭПР спиновых аддуктов
Рекомендумая литература:
Рекомендумая литература:

Презентация на тему: «Электронный Парамагнитный Резонанс и его применение в медико-биологических исследованиях». Автор: Magin Dmitri. Файл: «Электронный Парамагнитный Резонанс и его применение в медико-биологических исследованиях.ppt». Размер zip-архива: 850 КБ.

Электронный Парамагнитный Резонанс и его применение в медико-биологических исследованиях

содержание презентации «Электронный Парамагнитный Резонанс и его применение в медико-биологических исследованиях.ppt»
СлайдТекст
1 Электронный Парамагнитный Резонанс и его применение в

Электронный Парамагнитный Резонанс и его применение в

медико-биологических исследованиях

А. Н. Осипов, Ю.А. Владимиров

Российский Государственный Медицинский Университет Кафедра биофизики

2 Электронный Парамагнитный Резонанс

Электронный Парамагнитный Резонанс

Часть 1. Основы метода ЭПР

3 Электронный парамагнитный резонанс

Электронный парамагнитный резонанс

Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР, EPR, ESR) - один из основных прямых методов обнаружения и идентификации (изучения строения) свободных радикалов и комплексов металлов переменной валентности, имеющих неспаренный электрон на молекулярной орбитали. В основе метода лежит резонансное поглощение электромагнитного излучения неспаренными электронами, помещенными в магнитное поле.

Атом водорода

Электрон в атоме участвует в двух видах движения: 1. Орбитальном (l) - вокруг ядра атома и 2. Спиновом (s) - вокруг собственной оси. Каждый вид движения можно охарактеризовать двумя моментами: 1. Механическим (P), отражающим движение материальной частицы и 2. Магнитным (m), отражающим движение заряженной частицы.

4 Взаимосвязь механического и магнитного моментов

Взаимосвязь механического и магнитного моментов

Из классической механики известно, что момент количества движения электрона на круговой орбите радиуса R P=mvR, где m - масса электрона, а v - его скорость.

Движение заряженной частицы по такому же контуру, создает магнитный момент, подобный тому, что возникает при движении тока m=IS, где I - сила тока в контуре (I=ve/2pR), а S - площадь контура (S=pR2) или m=veR/2 или, учитывая (P=mvR) m=-eP/2m (или m/P=-e/2m) Из квантовой механики известно, что P=nh/2p, где n - главное квантовое число. Тогда при n=1 получим m=-eh/4pm=b (магнетон Бора)

5 Суммарный магнитный момент

Суммарный магнитный момент

Таким образом, для орбитального движения ml/Pl=-e/2m Для спинового движения ms/Ps=-e/m Суммарный магнитный момент равен: mj=ml+ms, А суммарный механический равен: Pj=Pl+Ps Однако mj/Pj?ml/Pl ? ms/Ps поэтому вводят коэффициент пропорциональности (g) mj/Pj=-g*e/2m, где g это g-фактор, т.е. коэффициент, показывающий вклад орбитального и спинового момента в суммарный момент. В конечном итоге, поскольку ml??ms, то mj?ms и mj?-g*e/2m*h/2p*S =-gbS

6 Энергия электрона в магнитном поле

Энергия электрона в магнитном поле

равна E=m*H*cos(m,H), где m - суммарный магнитный момент электрона, H - напряженность магнитного поля, cos(m,H) - угол между векторами m и H (обычно = 1 или -1), тогда подставив значение m получим E=-gbSH, Где S - спиновое квантовое число = +1/2 или -1/2. В итоге E=±1/2gbH

7 Ориентация электронных спинов в магнитном поле

Ориентация электронных спинов в магнитном поле

В отсутствие внешнего магнитного поля все механические и магнитные спиновые моменты электрона ориентированы случайным образом

В присутствии внешнего магнитного поля они могут быть ориентированы только двумя способами: по полю или против поля.

В отсутствие магнитного поля

При включенном магнитном поле

8 H

H

E

H=0

H

Расщепление энергетических уровней в магнитном поле (эффект Зеемана)

E0

В отсутствие внешнего магнитного поля электроны ориентированы случайным образом и имеют практически одинаковую энергию (E0)

.

При наложении магнитного поля магнитные моменты электронов ориентируются по полю или против поля. Их энергии изменяются, а энергетический уровень расщепляется на два.

9 E = hn

E = hn

Поглощение электромагнитных волн (явление ЭПР)

-1/2 gbH

DE = gbH

+1/2 gbH

Поглощение будет происходить при условии равенства энергий поглощаемого кванта и энергии перехода между уровнями, т.е. когда hn = gbH Это выражение называется – основным уравнением резонанса

E

H

Система, где электроны распределены между двумя энергетическими уровнями, может поглощать электромагнитное излучение. При определенных значениях величины энергии падающего кванта (hn) , будут происходить переходы электронов между уровнями.

10 Почему ЭПР можно наблюдать только у парамагнетиков

Почему ЭПР можно наблюдать только у парамагнетиков

ns=?

ns=?

Ns=? - число электронов c s=?. Ns= -? - число электронов c s= -?.

ns= -?

ns= -?

Разность между числом электронов (заселенностью) на двух разных энергетических уровнях в парамагнетиках определяется уравнением Больцмана:

Диамагнетик

Парамагнетик

11 История открытия явления ЭПР

История открытия явления ЭПР

Метод был открыт Евгением Константиновичем Завойским в Казанском Университете в 1944 году. Он заметил, что монокристалл CuCl2, помещенный в постоянное магнитное поле поглощает радиоволны в микроволновом диапазоне. Пионерами применения ЭПР в биологических исследованиях были Л.А. Блюменфельд и А.Э. Калмансон, которые в 1958 с помощью метода ЭПР обнаружили свободные радикалы полученные под действием ионизирующего излучения на белки.

12 ЭПР спектрометр

ЭПР спектрометр

Детектор

Аттенюатор

Записывающее устройство

Усилитель

Двойной Т-мост

Микроволновой резонатор

Образец

Микроволновой источник (клистрон)

13 В Казанском ГУ

В Казанском ГУ

14 Прибор Завойского для измерения ЯМР и ЭПР

Прибор Завойского для измерения ЯМР и ЭПР

15 Прибор Завойского для измерения ЭПР

Прибор Завойского для измерения ЭПР

16 Как получить сигнал ЭПР

Как получить сигнал ЭПР

Поглощение электромагнитных волн в радиоспектрометре ЭПР можно определять двумя способами:

1 - При постоянном магнитном поле, мы можем изменять частоту излучения. Максимальное поглощение будет наблюдаться при резонансе, когда h? = g?H При этом ожидаемый спектр будет таким:

2 - По техническим причинам мы поступаем по другому: мы используем микроволновое излучение при постоянной частоте волн и изменяем магнитное поле.

17 Что такое сигнал ЭПР

Что такое сигнал ЭПР

? = const

h? = g?H

Кроме того, в результате усиления сигнала ЭПР (путем его модуляции) мы получаем не поглощение A, а - первую производную поглощения по полю dA/dH.

H

h? = g?H

dA/dH

H

Поглощение

18 Электронный Парамагнитный Резонанс

Электронный Парамагнитный Резонанс

Часть 2. Спектры ЭПР

19 Примеры сигналов ЭПР

Примеры сигналов ЭПР

300 K

77 K

УФ облученный цистеин

Печень крысы при 77 K

g=2,25

g=1,94

g=4,3

g=2,00

Нитрозильные комплексы g=2,03

Метгемоглобин

Цитохром P-450

Радикалы аскорбата

Fe-s белки

20 Основные характеристики сигнала ЭПР

Основные характеристики сигнала ЭПР

4) сверхтонкая структура

21 C = Cs(S / SS)

C = Cs(S / SS)

Амплитуда сигнала ЭПР

А

dA/dH

сигнал ЭПР

H

Кривая поглощения

A

H

Площадь под кривой поглощения

C = k*S

Амплитуда сигнала ЭПР зависит от количества поглощающих частиц и пропорциональна площади под кривой поглощения, т.е. второму интегралу от сигнала ЭПР.

Где k - коэффициент зависящий от условий измерения.

Площадь S под линией поглощения прямо пропорциональна концентрации пара-магнитных частиц в измеряемом образце (C).

Практически получить значения S нетрудно. Существенно труднее найти величину k. Поэтому на практике при вычислении С обычно пользуются сравнением площади измеряемого образца S (концентрацию которого надо найти) с площадью эталонного образца Se (концентрация Ce которого известна).

Второй интеграл-это площадь (S) под кривой поглощения (т.е. это число)

22 Ширина сигнала ЭПР

Ширина сигнала ЭПР

Ширина сигнала ЭПР определяется взаимодействием магнитных моментов электрона с окружением. Теоретически минимальная ширина линии следует из соотношения неопределенностей Гейзенберга:

Рассматриваемый процесс - это поглощение электромагнитного кванта, такое, что D t может быть интерпретировано как время нахождения электрона на верхнем энергетическом уровне (время релаксации T ), а D E как энергия системы нашем случае = gbH, отсюда

dA/dH

Где D t - время измерения и DE - неопределенность энергии системы.

23 Время релаксации

Время релаксации

Спин-решеточная релаксация (T1) обусловлена взаимодействием магнитного момента электрона с решеткой (т.е. средой в которой находятся парамагнитные частицы).

Спин-спиновая релаксация (Т2) Обусловлена взаимодействием– с другими парамагнитными частицами (т.е. спинами)

Процесс релаксации характеризуется временем релаксации. Время релаксации (т.е. время нахождения электрона в состоянии с большей энергией) зависит от двух процессов: спин-решеточной и спин-спиновой релаксации.

Релаксация - процесс восстановления заселенности энергетических уровней после поглощения кванта электромагнитного излучения.

Время релаксации

24 Малое T Большое DH

Малое T Большое DH

Большое T Малое DH

Зависимость суммарного времени релаксации (Т) от Т1 и Т2 выражается формулой:

Тогда выражение для ширины сигнала ЭПР будет выглядеть так:

Комплексы металлов - T1=1 нс DH=10 мТ Свободные радикалы - T1=0,1 мс DH=100 мкТ

25 R1

R1

R2

Механизмы уширения сигнала ЭПР :

1. Взаимодействие магнитных моментов двух парамагнитных частиц (радикалов или ионов) приводит к уширению по диполь-дипольному механизму

2. Взаимодействие спинового магнитного момента электрона с орбитальным магнитным моментом электрона приводит к уширению сигнала в результате анизотропии g-фактора

3. Взаимное превращение форм радикала вызывает динамическое уширение сигнала

4. Соударение радикала с другим радикалом или парамагнитным ионом лежит в основе уширения за счет спинового обмена

26 G-фактор

G-фактор

Следовательно, при увеличении H происходит снижение g, и наоборот. Однако, величину Н нельзя считать характеристикой сигнала ЭПР, т.к. при изменении n резонанс будет происходить уже при других значениях Н. Величина g не изменяется при изменении Н (т.е. она инвариантна от метода измерения), и поэтому g-фактор - характеристика сигнала ЭПР.

g-фактор сигнала ЭПР - это не только параметр, отражающий вклад орбитального и спинового моментов в суммарный магнитный момент, но и характеристика, показывающая положение сигнала ЭПР во всем диапазоне магнитного поля.

Из основного уравнения резонанса следует, что

При n=const

Увеличение H

Увеличение g

g=4,3

g=2,25

g=2,00

Цитохром P-450

Метгемоглобин

Радикалы аскорбата

g=1,94

Fe-s белки

27 Сверхтонкое взаимодействие

Сверхтонкое взаимодействие

H

H3C

OH

Электрон

Протон

Протоны

Взаимодействие магнитного момента неспаренного электрона с магнитным моментом ядра соседнего атома (например, H или N) называется сверхтонким взаимодействием и приводит к появлению сверхтонкой структуры сигнала ЭПР

Протон имеет магнитный момент который ориентирован во внешнем магнитном поле (Ho) в двух направлениях (вдоль и поперек поля) т.к. подобно электрону, имеет спиновое число S = ±1/2.

Магнитный момент протона создает магнитное поле (+Hp или –Hp, зависящее от ориентации протона), которое складывается с внешним магнитным полем (Н0).

Отсюда следует, что суммарная величина поля, приложенного к неспаренному, электрону будет немного больше (H0 + Hp)(если спин протона=1/2) или немного меньше (H0 - Hp), чем в отсутствии протона (H0) (если спин протона=-1/2).

В результате такого взаимодействия, сигнал ЭПР (который бы в отсутствии протона состоял из одной линии) будет состоять из двух линий

Расстояние между линиями будет зависеть от величины магнитного поля создаваемого протоном в месте нахождения неспаренного электрона, которое в свою очередь зависит от расстояния между электроном и протоном

28 Сверхтонкая структура

Сверхтонкая структура

Неспаренный электрон в радикале может быть расположен близко к двум протонам, как в радикале этанола (.CH2-CH2-OH)

H

H

HC

OH

H

H0 + Hp1 + Hp2 = H0 + 2Hp H0 + Hp1 - Hp2 = H0 H0 – Hp1 + Hp2 = H0 H0 – Hp1 - Hp2 = H0 - 2Hp

2Hp

2Hp

В конечном итоге вместо одного сигнала будет три с соотношением интенсивностей 1:2:1

Электрон

Протон

Магнитное поле вокруг неспаренного электрона теперь может иметь следующие значения:

Как результат, сигнал ЭПР радикала расщепляется на 3 линии

Состояние Н=Н0 реализуется двумя способами (а Н=Н0+2Нр или Н=Н0-2Нр только одним), следова-тельно вероятность этого состо-яния (и интенсивность сигнала) будут вдвое больше.

Расстояние между линиями (в данном случае 2Нр) является основной характеристикой взаимодействия неспаренного электрона с магнитным ядром. Эта величина называется, также, константой сверхтонкого взаимодействия.

29 Сверхтонкое взаимодействие (продолжение)

Сверхтонкое взаимодействие (продолжение)

N=O

H3C

Сh

H0 - Hp

H0 + Hp

H0+0

Протон

Электрон

Азот

Электрон

Атом азота имеет магнитный момент который ориентирован во внешнем магнитном поле (Ho) в трех направлениях (вдоль поля, против поля и «поперек» поля) имеет спиновое число S = ±1 и 0.

Магнитный момент азота создает магнитное поле (+Hp или –Hp, и Н=0), которое складывается с внешним магнитным полем (Н0).

Отсюда следует, что суммарная величина поля, приложенного к неспаренному, электрону будет немного больше (H0 + Hp)(если спин азота=1) или немного меньше (H0 - Hp), чем в отсутствии азота (H0) (если спин азота=-1), либо не изменяется, если спин =0.

В результате такого взаимодействия, сигнал ЭПР (который бы в отсутствии протона состоял из одной линии) будет состоять из трех линий

30 Электронный Парамагнитный Резонанс

Электронный Парамагнитный Резонанс

Часть 3. Практическое применение в медико-биологических исследованиях

31 Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:

Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:

естественные сигналы ЭПР метод спиновых меток и зондов метод спиновых ловушек

32 Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:

Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:

естественные сигналы ЭПР метод спиновых меток и зондов метод спиновых ловушек

33 Спектр ЭПР печени крысы

Спектр ЭПР печени крысы

Если взглянуть на спектр ЭПР, например, печени крысы, то можно увидеть сигналы цитохрома Р-450, сигнал метгемоглобина и сигнал свободных радикалов, принадлежащий семихинонным радикалам аскорбиновой кислоты и флавинов. Благодаря коротким временам релаксации сигналы ЭПР металлопротеинов можно наблюдать только при низкой температуре, например, температуре жидкого азота (77 К).

цитохром Р-450

Свободные радикалы

Fe-s белки

g=2,25

g=2,03

g=2,00

g=4,3

g=1,94

100 Гс

34 Радикал аскорбата

Радикал аскорбата

Радикал аскорбата

Аскорбат

Дегидроаскорбат

+ Пероксидаза

Сигнал ЭПР радикала аскорбата можно наблюдать непосредственно в крови или плазме. Добавление пероксидазы приводит к увеличению сигнала ЭПР и последуюему его исчезновению. Длитель-ность кинетики пропорци-ональна концентрации аскорбата в крови.

35 Естественные сигналы ЭПР, наблюдаемые в биологических системах

Естественные сигналы ЭПР, наблюдаемые в биологических системах

hn

Спектр ЭПР облученного УФ светом цистеина

Повысить концентрацию свободных радикалов, для избежания трудностей при их изучении, можно затормозив их гибель и повысив скорость их образования. Это можно сделать путем облучения (УФ или ионизирующей радиацией) биологических объектов находящихся при низкой температуре.

36 Сигналы ЭПР семихинонных или феноксильных радикалов

Сигналы ЭПР семихинонных или феноксильных радикалов

Феноксильный радикал a-токоферола

Семихинонный радикал a-токоферола

Семихинонный радикал убихинона Q10

37 Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:

Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:

естественные сигналы ЭПР метод спиновых меток и зондов метод спиновых ловушек

38 Метод спиновых зондов

Метод спиновых зондов

Спектр ЭПР нитроксильных радикалов состоит, в простейшем случае, из трех линий равной интенсивности, благодаря взаимодействию неспаренного электрона с ядром атома азота, имеющим целочисленный спин, равный ±1 или 0.

Формула и спектр ЭПР нитроксильного радикала 2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-оксил (ТЕМПО).

39 Cпектр ЭПР ТЕМПО при разных tс

Cпектр ЭПР ТЕМПО при разных tс

Если нитроксильный радикал находится в водном растворе, то его вращение является изотропным и достаточно быстрым. Это движение можно охарактеризовать временем корреляции (tс):

При уменьшении скорости вращения проявляются анизотропные взаимодействия, которые приводят к уширению линий и соответственно изменению амплитуд компонент спектра, а затем и к сдвигу крайних компонент.

Время корреляции tc

Где DH +1 - ширина низкопольной компаненты I+1 - амплитуда низкопольной компаненты I-1 - амплитуда высокопольной компаненты

10 Gs

40 Время корреляции нитроксильного радикала непосредственно связано с

Время корреляции нитроксильного радикала непосредственно связано с

микровязкостью среды

Используя уравнение Стокса-Эйнштейна можно определить значение вязкости в соответствующей макроскопической системе

где R - эффективный радиус нитроксильного радикала. T – абсолютная температура t - время корреляции ? - вязкость Из уравнения видно, что используя нитроксильный радикал в качестве зонда, можно определить микровязкость среды, в которой находится радикал. В биологических исследованиях этот прием широко используется для измерения микровязкости биологических мембран.

41 Параметр гидрофобности f

Параметр гидрофобности f

Представленные спектры ЭПР отражают поведение зонда ТЕМПО в средах с различной гидрофобностью. Определив отношения a / (a + b) или (a / c) в этом спектре, можно посчитать параметр гидрофобности f, показывающий сколько и в какой фракции мембраны содержится зонда. Параметр f удобен при изучении процессов перекисного окисления в мембранах.

a

b

c

42 Спектр ЭПР спинового зонда 5-доксил стеарата в мембране эритроцита

Спектр ЭПР спинового зонда 5-доксил стеарата в мембране эритроцита

При анизотропном вращении стеариновой кислоты вокруг длинной оси сигнал ЭПР будет сильно зависеть от степени анизотропии вращения, который количественно характкризуется так называемым параметром упорядоченности S

Определить параметр упорядоченности S, можно измерив константы сверхтонкого расщепления – А|| и А? и подставив их значения в формулу

43 Параметр упорядоченности и вязкость мембраны

Параметр упорядоченности и вязкость мембраны

Параметр упорядоченности S равен 1, есливращение зонда происходит только вокруг нормали к плоскости мембраны.

В «замороженных» мембранах, где липиды находятся в кристаллическом состоянии параметр упорядоченности S близок к 1.

В «жидких» мембранах отклонение конуса вращения возрастает и S снижается, что вызывает изменения в спектре ЭПР.

44 Изменения сигнала ЭПР при уменьшении S и возрастании угла отклонения

Изменения сигнала ЭПР при уменьшении S и возрастании угла отклонения

конуса вращения g

45 Изменения сигнала ЭПР при удалении нитроксильного радикала от полярной

Изменения сигнала ЭПР при удалении нитроксильного радикала от полярной

карбоксильной группы жирной кислоты

С-5

С-9

С-12

С-16

46 Cпектр ЭПР рН чувствительного зонда (pK=4,7) при разных рН

Cпектр ЭПР рН чувствительного зонда (pK=4,7) при разных рН

Казалось бы, что измерение рН достаточно легко и точно можно проводить с помощью рН-электродов, однако очень трудно если не невозможно измерить рН внутри лизосомы или фагоцитирующего лейкоцита. Для этих целей и применяют рН-чувствительные спиновые зонды. В основе метода рН-чувствительных зондов лежит способность зонда давать отличные друг от друга спектры ЭПР в протонированной и депротонированной формах.

Таким образом, существует узкий диапазон рН в котором и происходит его протонирование и соответствующее изменение спектра ЭПР зонда.

47 Зависимость параметра f и aN от рН

Зависимость параметра f и aN от рН

aN=(aNR + aNRH+)/2

f =(IR)/(IR + IRH+)

aNR и aNRH+ константы СТВ радикалов R и RH+

IR и IRH+ амплитуды сигналов ЭПРрадикалов R и RH+

48 Спектр ЭПР химотрипсина с присоединенной спиновой меткой

Спектр ЭПР химотрипсина с присоединенной спиновой меткой

Спектр ЭПР нативного химотрипсина, помеченного спиновой меткой.

Соотношение величин I0 и I1 используется для количественной характеристики подвижности спиновой метки.

Денатурация белка приводит к увеличению подвижности полипептидных цепей и соответственно увеличению подвижности спиновой метки.

I0

I1

49 Белок

Белок

Спектры ЭПР спиновой метки при взаимодействии с SH-группами белка

1. Водная фаза

2. Поверхностный слой

3. Глубинный участок

В основе метода спиновых меток лежит тот же принцип изменения спектра ЭПР нитроксильного радикала в зависимости от скорости и изотропности его вращения. Отличием же метода является тот факт, что спиновая метка ковалентно связывается с другой более или менее крупной молекулой или макромолекулой.

50 Сигнал ЭПР спиновой метки в гемоглобине

Сигнал ЭПР спиновой метки в гемоглобине

Аллостерические эффекты в гемоглобине, меченым иминоксольным радикалом в геминовой группе при 25C. a - спектры ЭПР, b - путь включения метки в a-цепи гемоглобина и присоединение О2 к геминовой группе в b-цепях. R - spin labels.

51 Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:

Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:

естественные сигналы ЭПР метод спиновых меток и зондов метод спиновых ловушек

52 R• + ST

R• + ST

SA•

Основы метода спиновых ловушек (spin trapping assay)

Концентрация свободных радикалов в клетках и тканях не превышает 10 нМ. Минимальная концентрация свободных радикалов, которую можно обнаружить методом ЭПР 100 нМ

Предложен в 1965-67 независимо Konaka T. (Япония), R. Lagercranz (Швеция) и E. Janzen (Канада).

53 Характеристики спектра ЭПР спиновых аддуктов

Характеристики спектра ЭПР спиновых аддуктов

A-фенил-n-трет-бутил нитрон (PBN)

PBN спиновый аддукт

abH

DHpp

aN

54 Основные виды спиновых ловушек

Основные виды спиновых ловушек

Нитрозосоединения

Нитроны

DEPMPO

Трет-нитрозобутан

Нитронил-нитроксилы

PBN

Нитрозобензол

DMPO

NNR

55 Основные требования к спиновым ловушкам

Основные требования к спиновым ловушкам

Быстрые реакции с радикалами Отсутствие побочных реакций Образование стабильных аддуктов Отличие в параметрах спектра ЭПР спиновых аддуктов у разных радикалов

56 Кинетические и спектральные характеристики спиновых аддуктов

Кинетические и спектральные характеристики спиновых аддуктов

R3-C•

4.3*107

Вода

15.3

3.4

0.8

R-O•

1.2*108

Вода

15.2

3.0

0.5

R-OO•

4.0*102

Вода

15.4

3.0

0.5

OH •

8.5*109

Вода

14.9

2.8

0.5

O2•

5.0*108

Вода

14.9

2.7

0.5

aN

abH

DHpp

Радикал

Константа скоросмти

Р-ритель

57 Идентификация радикалов по спектрам ЭПР спиновых аддуктов

Идентификация радикалов по спектрам ЭПР спиновых аддуктов

Если известны: (1) тип СЛ, (2) Р-ритель, (3) aN (мТ) и (4) abH (мТ) СА можно легко идентифицировать в базе данных http://epr.niehs.nih.gov спектров ЭПР.

OH•; Morgan D.D. et. al., Photochem. Photobiol. 1985, v. 42, p. 93-99

DMPO

OH•; Thornalley P.J. et al., Biochem. Biophys. Acta 1985, v. 827, p. 36-44

aqueous

OH•;Makino K. et al., Biochim. Biophys. Res. Commun. 1986, v. 141, p. 381-386

1.49

1.49

OH•; Minotti G. et al., J. Biol. Chem. 1987, v. 262, p. 1098-1104

58 Рекомендумая литература:

Рекомендумая литература:

Дж. Вертц и Дж. Болтон Теория и практические приложения метода ЭПР. Мир, Москва, 1975. Современные методы биофизических исследований. Практикум по биофизике. Под редакцией А.Б. Рубина. Высшая школа, Москва, 1988. Метод спиновых Меток. Теория и применение. Под редакцией Л. Берлинера. Мир, Москва, 1979. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. Наука, Москва, 1976. Зубарев В.Е. Метод спиновых ловушек. Издательство МГУ, Москва, 1984.

«Электронный Парамагнитный Резонанс и его применение в медико-биологических исследованиях»
http://900igr.net/prezentacija/biologija/elektronnyj-paramagnitnyj-rezonans-i-ego-primenenie-v-mediko-biologicheskikh-issledovanijakh-148514.html
cсылка на страницу

Биосфера

15 презентаций о биосфере
Урок

Биология

136 тем
Слайды
900igr.net > Презентации по биологии > Биосфера > Электронный Парамагнитный Резонанс и его применение в медико-биологических исследованиях