Методы прямой трансформации растений

Эукариотическая клетка
<< Минисателлиты в эукариотических геномах		Протопласты растительных клеток как объекты биологического конструирования >>

Лекция 9. МОДЕЛИРОВАНИЕ ГЕНОТИПА КЛЕТКИ ТРАНСФОРМАЦИЯ ОРГАНЕЛЛ Алло -	Моделирование генотипа ядерно-цитоплазматических химер	Моделирование на уровне организма	Реципрокные гибриды являются не самой удачной моделью для изучения	Моделирование на уровне организма
Геномы аллолиний				Одна из самых больших в мире коллекций аллоплазматических линий
Коллекция, сочетающая геномы 7 сортов культурного ячменя Hordeum	Моделирование на уровне клетки	Сегрегация пластид у цибридов может происходить в пользу как одного,	При повреждении пластид гербицидом цибриды гомопластидны	Как ведут себя органеллы у цибридов
До завершения сегрегации органелл в клетках соматических гибридов	Соматическая гибридизация и замещение клеточных органелл у животных	В гибридных клетках животных была обнаружена рекомбинация	Сегрегация митохондриальной ДНК мыши в клеточных гибридах мыши и	Насыщающие скрещивания у животных – долгий и неудобный путь
Эксперимент по созданию гибридных эмбрионов между Mus musculus L. and	Жизнеспособные «ксеномитохондриальные» цибриды	Причина, по которой происходит сегрегация митохондрий B. indicus,	Моделирование на уровне геномов органелл (трансформация отдельных	Первая трансформация Chlamydomonas
Что нужно для успешной трансформации пластид	1987 г. - Разработан метод «биолистической» трансформации включающего	Во всех экспериментах по трансформации пластид используют обычно	При создании транспластомных растений используют их "прокариотические"	Как удается встроить в пластом чужеродные гены
Почему транспластомные растения перспективнее трансгенных	Первое практическое биотехнологическое применение транспластомных	Еще один пример: наработка транспластомными растениями гормона роста	Получены транспластомные томаты с экспрессией трансгена в плодах	Внутриклеточное перераспределение генов
Reverse genetics – выяснение роли пластидного гена ycf3	Лекция 9. МОДЕЛИРОВАНИЕ ГЕНОТИПА КЛЕТКИ ТРАНСФОРМАЦИЯ ОРГАНЕЛЛ Алло -	Области исследования и практического применения нехромосомной

Презентация: «Методы прямой трансформации растений». Автор: USER. Файл: «Методы прямой трансформации растений.ppt». Размер zip-архива: 1175 КБ.

Методы прямой трансформации растений

содержание презентации «Методы прямой трансформации растений.ppt»

№	Слайд	Текст
1		Лекция 9. МОДЕЛИРОВАНИЕ ГЕНОТИПА КЛЕТКИ ТРАНСФОРМАЦИЯ ОРГАНЕЛЛ Алло - и изоплазматические линии растений Соматические гибриды у растений и животных Генетическая трансформация клеточных органелл Биотехнологические задачи и трансформация пластома Внутриклеточное перераспределение генов Инвертированная генетика.
2		Моделирование генотипа ядерно-цитоплазматических химер Все известные подходы к созданию ядерно-цитоплазматических химер можно условно разделить на три группы: Моделирование на уровне отдельных гибридных клеток и регенерантов, полученных из них Моделирование на уровне организма Моделирование на уровне геномов органелл Транспластомные томаты
3		Моделирование на уровне организма Реципрокные гибриды Изоплазматические линии Аллоплазматические линии Реципрокные гибриды b x A B a А(а) х В(в) = АВ (а) В(в) х А(а) = АВ (в)
4		Реципрокные гибриды являются не самой удачной моделью для изучения эффектов цитоплазматичесих генов, так как не всегда различия в фенотипе гибридов связаны с геномами органелл Как у растений, так и у животных яйцеклетка, несущая значительный запас различных биосинтетических компонентов (в том числе долгоживущих матричных РНК), может предопределять особенности развития организма. Этот материнский эффект обусловлен ядерными генами яйцеклетки, а не различием по органельным генам двух родителей Семена прямых и обратных гибридов F1 однодольных различаются геномами своих триплоидных эндоспермов – ААВ и АВВ, соответственно Генетические различия между эндоспермами могут вызывать различия в развитии растений, особенно на ранних стадиях их онтогенеза
5		Моделирование на уровне организма Аллоплазматические линии Изоплазматические линии Межвидовые скрещивания Внутривидовые скрещивания А А x В x А А b a x x В b AB a a B B 6-10 поколений насыщающих скрещиваний 6-10 поколений насыщающих скрещиваний
6		Геномы аллолиний Белки органелл аллолиний Х ? A(мтa хпa ) х ?B (мтb хпb )?b(мтa хпa ) “А” - белки пластид и митохондрий, кодируемые ДНК органелл “В” - белки пластид и митохондрий, кодируемые ДНК ядра Многократное беккроссирование ? A B Многократное беккроссирование Х ? Аллолиния В(А) Аллолиния В(А) ? A(мтa хпa ) х ?B (мтb хпb) ? b(мтb+aхпb+a) ? ? B A Мт Мт Хп Хп B . Схема наследования ДНК органеллами при создании аллолиний путем беккроссирования (при условии строго материнского наследования органелл). А – материнское растение, В – опылитель, В(А) – аллолиния, имеющая генотип ядра В (опылителя) и геномы органелл А (исходного материнского растения). Белки органелл аллолиний кодируются как ядром В (линии-опылителя) (б?льшая часть), так и собственными геномами органелл А (не более 1% всех белков, входящих в состав органелл). Мт Мт Хп Хп B “B+A” “B+A” А A
7		Одна из самых больших в мире коллекций аллоплазматических линий создана на пшенице В 1951 году японский генетик Kихара создал первую серию аллоплазматических линий Донор ядра, мягкая пшеница Сейчас коллекция аллоплазматической пшеницы, созданной в Японии учениками и последователями Kihara, включает линии с ядерными генотипами 12 сортов гексаплоидной мягкой пшеницы и цитоплазматическими геномами 8 различных видов пшениц (10 источников) и 24 видов эгилопсов (36 источников) – всего 552 комбинации Донор цитоплазмы, дикий злак Aegilops ovata Triticum aestivum
8		Коллекция, сочетающая геномы 7 сортов культурного ячменя Hordeum vulgare и цитоплазматические геномы 12 форм дикого, полукультурного и культурного ячменя (H. vulgare и H. spontaneum) – всего 84 ядерно-плазменные комбинации, была создана в нашей лаборатории И.М.Голоенко под руководством О.Г.Давыденко Экспрессия ядерных генов, контролирующих морфологические и количественные признаки Фертильность Влияние генома органелл на процессы и свойства растений, изученные с помощью аллолиний Фотосинтетические и респираторные параметры Устойчивость к патогенам и другим стрессовым факторам Морфогенетические потенции Конъюгацию хромосом, трансмиссию и рекомбинацию отдельных компонентов ядерного генома
9		Моделирование на уровне клетки Гибридизация неполовых клеток растений – второй способ получения ядерно-цитоплазматических химер – впервые была выполнена в 1972 г. В последующее десятилетие это направление пережило настоящий бум: были опубликованы десятки работ, сообщавшие более чем о 70 экспериментах на различных видах Solanum Nicotiana Petunia Цибриды Brassica Glycine Arabidopsis Daucus Чьи органеллы обнаруживаются у цибридов ?
10		Сегрегация пластид у цибридов может происходить в пользу как одного, так и другого родителя Не удалось обнаружить гибрид, сочетающий пластиды S. tuberosum и митохондрии S. commersonii Если пластиды одного вида чем-то повреждены 6 растений с пластидами S. Tuberosum 8 растений с пластидами S. Commersonii Митохондрии P. hybrida несовместимы с ядром N.tabacum + S.tuberosum+S.commersonii + N. Tabacum – ядро ~ " N. Tabacum " митохондрии P. Hybrida- пластиды Цибрид жизнеспособный P. hybrida N. tabacum N. Tabacum – ядро N. Tabacum митохондрии P. Hybrida- пластиды Цибрид аномальный (митохондриальная ДНК рекомбинантная)
11		При повреждении пластид гербицидом цибриды гомопластидны S.tuberosum + S.commersonii Гербицид SAN 9789 вызывает обесцвечивание пластид + Все растения с пластидами S. commersonii Растения с пластидами S. Tuberosum
12		Как ведут себя органеллы у цибридов Иногда сегрегация происходит очень быстро, иногда для этого нужно до 20 клеточных поколений Получены цибриды: Попытка создать межсемейственный цибрид Solanum nigrum + N. tabacum успехом не увенчались внутривидовые, межвидовые межродовые Nicotiana tabacum + Petunia hybrida межтрибные N. tabacum (Я) +Salpiglossis sinuate (ХП)+ МТ рекомбинантного типа
13		До завершения сегрегации органелл в клетках соматических гибридов присутствуют пластиды и митохондрии обоих родителей Что происходит с их геномами в этот период? Рекомбинация хлоропластных ДНК– явление крайне редкое, либо редко обнаруживаемое у наземных растений Гораздо чаще рекомбинации хлоропластных ДНК наблюдаются у межвидовых гибридов одноклеточной зеленой водоросли Сhlamydomonas Рекомбинации митохондриальных ДНК удается выявлять значительно чаще, чем хлоропластных. Кроме родительских молекул мтДНК у соматических гибридов, как правило, обнаруживаются также новые последовательности, которые обычно являются результатом рекомбинаций между исходными типами мтДНК
14		Соматическая гибридизация и замещение клеточных органелл у животных История гибридизации соматических клеток животных еще более длительная, чем у растений Первые спонтанно слившиеся клетки обнаружены barski и сотрудниками еще в 1960 году, а в середине 60-х годов получены первые искусственные межвидовые гибриды
15		В гибридных клетках животных была обнаружена рекомбинация митохондриальных ДНК, которая в клеточных гибридах мыши и человека происходит с высокой частотой Энуклеация ооцита -микроманипуляция При клонировании животных только 1-5% реконструированных эмбрионов доживают до взрослых животных
16		Сегрегация митохондриальной ДНК мыши в клеточных гибридах мыши и человека была показана уже в ранних работах Была найдена корреляция между утратой хромосом одного из родителей гибрида и соответствующей сегрегацией его митохондриальной ДНК При этом утрата мтДНК опережает сегрегацию хромосом одного из родителей
17		Насыщающие скрещивания у животных – долгий и неудобный путь При экспериментальных попытках замены цитоплазмы у животных прибегают к прямой реконструкции путем переноса ядра в ооцит У широко известной овечки Долли, впервые клонированной из соматической клетки, перенесенной в ооцит другой овцы, мтДНК отличалась от таковой донора ядра и полностью соответствовала мтДНК ооцита хозяина Ядерный геном постепенно замещался на В. indicus, тогда как митохондрии (которые передаются по материнской линии) - остались от B. taurus Bos indicus Многократное спаривание Bos taurus Американские коровы европейского происхождения Быки из Индии
18		Эксперимент по созданию гибридных эмбрионов между Mus musculus L. and Rattus norvegicus L. Развитие цибрида блокируется на стадии 1-2 клеток Развитие цибрида блокируется на стадии 5-8 клеток Развитие цибрида идет до стадии морулы Ядро крысы неспособно существовать в цитоплазме мыши Предварительная энуклеация Ооцит мыши Перенос ядра крысы Ооцит мыши Перенос ядра крысы Перенос цитоплазмы крысы Ооцит мыши
19		Жизнеспособные «ксеномитохондриальные» цибриды Митохондрии гориллы Митохондрии гориллы Митохондрии шимпанзе Митохондрии Bos indicus + Bos taurus Ядро Bos indicus Ядро человека При дальнейших циклах деления данной цибридной клетки количество копий митохондриальной ДНК Bos indicus быстро уменьшалось, и животное-регенерант, полученное при имплантации в корову зародыша на стадии бластоциста, содержало митохондриальные ДНК исключительно от Bos taurus (разрешающая способность измерений составляла 0,05% мтДНК)
20		Причина, по которой происходит сегрегация митохондрий B. indicus, неясна; предполагают, что это результат различий в скорости репликации органелл. В эксперименте тех же авторов на гибридной линии мышей наблюдалась стабильная гетероплазмия по мтДНК до 15-го поколения гибридных клеток. ИТАК, попытки конструирования клеточных химер в ряде случаев увенчались успехом и у животных, и у растений. Практически полезных химер немного. Но – они позволили познать ряд механизмов ядерно-цитоплазматического взаимодействия
21		Моделирование на уровне геномов органелл (трансформация отдельных генов в геномы органелл) Вехи разработки метода генетической трансформации 60-ые годы – генетическая трансформация ядра. 1984 – перенос в Е.coli и B.subtilis пластидного rbcL гена и его экспрессия 1987 – разработка метода биолистической трансформации 1988 - трансформация пластид Chlamydomonas и митохондрий дрожжей 1990 - трансформация пластид Nicotiana tabacum (3 из 150 обстрелянных растений)
22		Первая трансформация Chlamydomonas При создании транспластомных растений используют их "прокариотические" черты – чувствительность к антибиотикам, полицистронный тип устройства генома Обстрел частицами, несущими немутантный аналог гена Восстанавливается нарушенный фотосинтез Мутант по гену atpB Транспластомные растения – растения с трансгенами, встроенными в пластидный геном
23		Что нужно для успешной трансформации пластид Метод переноса гена через мембрану клетки и двойную мембрану пластид Селективный пластидный маркер, обеспечивающий отбор трансформантов Система культивирования, обеспечивающая эффективную регенерацию
24		1987 г. - Разработан метод «биолистической» трансформации включающего биологические и баллистические приемы Частицы золота или вольфрама диаметром от 0.4 до 1.7 микрона, покрытые ДНК трансформирующих плазмид Частицы проникают в клетки и клеточные органеллы
25		Во всех экспериментах по трансформации пластид используют обычно двойные мутанты устойчивости к антибиотикам, так как частота спонтанного мутирования пластома достаточно велика Признак устойчивости к антибиотику был первым, перенесенным в пластиды табака Трансформационный вектор пластид pZS148 состоит из pBluescript KS+ вектора, в который встроен Sac I–EcoRV фрагмент пластидной РНК. Выделена светлым 16S рДНК. Указаны относительные позиции мутаций резистентности к антибиотикам стрептомицину (str-1) и спектиномицину (spc-2) и Pst1 линкера (*). 2.9-т.п.н. Sal 1 фрагмент включает область, связанную с репликацией (pt ori) al., Из 148 обстрелянных листьев табака было отобрано три транспластомных устойчивых клона
26		При создании транспластомных растений используют их "прокариотические" черты – чувствительность к антибиотикам, полицистронный тип устройства генома Включение чужеродного гена (ген Т) в пластом путем генетической трансформации Плазмида встраивается в пластидный геном в строго определенном месте, а именно туда, где находятся последовательности, гомологичные имеющимся в плазмиде Конструкция оказывается стабильно включенной в пластом A B Пластидная ДНК после трансформации Ген А ген В ген Т aadA ген С ген D ген В ген С
27		Как удается встроить в пластом чужеродные гены Успешной трансформации можно добиться при встраивании гетерологичных последовательностей, если фланкировать их гомологичными ДНК фрагментами Размер фланкирующих гомологичных хпДНК последовательностей с каждой стороны должен составлять не менее 1 т.п.н., размер гетерологичной последовательности при этом может изменяться от 1.3 до 3.7 т.п.н
28		Почему транспластомные растения перспективнее трансгенных 1. Высокий уровень экспрессии трансгена и накопления чужеродного белка. Причина - полиплоидность пластидных генетических систем и высокая стабильность чужеродных белков в пластидах. 2. Возможность экспрессировать в пластидах целые бактериальные опероны, отвечающие за какой-либо биосинтетический путь. 3. Трансгены встраиваются в пластидный геном по принципу гомологичной рекомбинации, в ядерный - хаотично. Следовательно, все трансформанты пластид возникающие из одной и той же конструкции, находятся в совершенно равноценном положении и значит не отличаются уровнем экспрессии трансгена 4. При трансформации ядерных генов у растений нередко низкий уровень экспрессии трансгенов связан с массой эпигенетических эффектов или механизмом «генного безмолвия» (gene silencing), в пластидах этого не происходит. 5. Не происходит бесконтрольного переноса пластидных трансгенов с пыльцой (почему?)
29		Первое практическое биотехнологическое применение транспластомных растений: !!! Встраивание гена Bt в хлоропластный геном табака Экспрессия гена токсина Bacillus thuringiensis в растениях табака: Bt токсин составлял 3-5% от общего растворимого белка клетки Растения проявляли устойчивость к личинкам травоядных насекомых В дальнейшем титр токсина удалось повысить до 45% от общего растворимого белка клетки, при этом в хлоропластах образовывались кристаллы белка-токсина Наблюдалась 100%-ая гибель насекомых после дегустации трансформированных листьев
30		Еще один пример: наработка транспластомными растениями гормона роста человека - соматотропина Далее – предполагалось использовать протоколы трансформации пластид для основных пищевых культур Гормон в пластидах правильно укладывался во вторичную структуру Количество гормона достигало до 7% от общего растворимого белка клетки Концентрация рекомбинантного белка в клетке более чем в 300 раз превышала таковую при трансформации данным геном ядерного генома Для получения транспластомных растений картофеля и томатов потребовалось еще 10 лет
31		Получены транспластомные томаты с экспрессией трансгена в плодах (хромопласты) “plantibodies” Первые успехи по пластидной трансформации достигнуты у арабидопсиса, риса, видов Brassica В перспективе: Съедобные вакцины Антитела и другие фармакопрепараты
32		Внутриклеточное перераспределение генов Впервые искусственная замена митохондриальной копии гена на ядерную была выполнена на мутантных клетках дрожжей без ATP8 Гены трех субъединиц ATP (6,8,9) у дрожжей находятся в митохондриях Последовательность синтезирована химическим путем in vitro У нейроспоры ген субъединицы 9 переместился в ядро Sc wt Sc mit - TpN-atp9 atp6 atp8 atp6 atp8 atp9 N9/Y8 pLF1 TpN-atp8art atp6 atp9 atp6 atp9 TpN-atp8art Sctr N m N m N m N m
33		Reverse genetics – выяснение роли пластидного гена ycf3 Последствия инактивации гена ycf3
34
35		Области исследования и практического применения нехромосомной наследственности для улучшения растений
«Методы прямой трансформации растений»