Биосфера
<<  Биоэкономика, основанная на знаниях – стратегическая задача развития России в XXI веке Свидерская Ирина Викторовна кандидат биологических наук доцент кафедры биофизики  >>
Ngs и его применение в различных областях биологической науки
Ngs и его применение в различных областях биологической науки
Технологии секвенирования
Технологии секвенирования
Общая схема работы NGS: от исходной ДНК до «букв» на экране
Общая схема работы NGS: от исходной ДНК до «букв» на экране
Высокопроизводительное пиросеквенирование (454): принцип метода
Высокопроизводительное пиросеквенирование (454): принцип метода
454 – принцип метода
454 – принцип метода
Технологии секвенирования 2 поколения: 454
Технологии секвенирования 2 поколения: 454
Секвенирование Illumina: принцип метода
Секвенирование Illumina: принцип метода
Секвенирование Illumina - принцип метода
Секвенирование Illumina - принцип метода
Illumina – приборы
Illumina – приборы
Illumina – преимущества и недостатки
Illumina – преимущества и недостатки
Полупроводниковое секвенирование
Полупроводниковое секвенирование
Секвенирование путем лигирования (SOLiD)
Секвенирование путем лигирования (SOLiD)
Секвенирование единичных молекул
Секвенирование единичных молекул
Секвенирование единичных молекул
Секвенирование единичных молекул
Секвенирование единичных молекул
Секвенирование единичных молекул
Области применения NGS
Области применения NGS
Секвенирование геномов de novo: Amborella
Секвенирование геномов de novo: Amborella
Ngs и его применение в различных областях биологической науки
Ngs и его применение в различных областях биологической науки
Анализ транскриптома: перенос РНК от хозяина к паразиту
Анализ транскриптома: перенос РНК от хозяина к паразиту
Спасибо за внимание
Спасибо за внимание
Технологии секвенирования 2 поколения: области применения
Технологии секвенирования 2 поколения: области применения
Первое правило геномного секвенирования
Первое правило геномного секвенирования

Презентация: «Ngs и его применение в различных областях биологической науки». Автор: Masha. Файл: «Ngs и его применение в различных областях биологической науки.ppt». Размер zip-архива: 3653 КБ.

Ngs и его применение в различных областях биологической науки

содержание презентации «Ngs и его применение в различных областях биологической науки.ppt»
СлайдТекст
1 Ngs и его применение в различных областях биологической науки

Ngs и его применение в различных областях биологической науки

Мария Логачева 29.09.2014

2 Технологии секвенирования

Технологии секвенирования

1-е поколение

2-е поколение

3-е поколение

Sanger sequencing

3 Общая схема работы NGS: от исходной ДНК до «букв» на экране

Общая схема работы NGS: от исходной ДНК до «букв» на экране

приготовление библиотеки (дробление ДНК и лигирование адаптеров)

Амплификация индивидуальных фрагментов и отжиг праймеров

Регистрация сигнала

Синтез цепи, комплементарной секвенируемому фрагменту

интеграция сигнала, перевод в последовательность ДНК (basecalling)

4 Высокопроизводительное пиросеквенирование (454): принцип метода

Высокопроизводительное пиросеквенирование (454): принцип метода

Самая первая из технологий NGS (Margulies et al. Nature 2005; 441.7089)

5 454 – принцип метода

454 – принцип метода

При присоединении dNTP выделяется пирофосфат. Сульфурилаза преобразует пирофосфат + аденозинфосфосульфат в АТФ. АТФ используется для окисления люциферина люциферазой. Световой сигнал регистрируется фотокамерой.

Через лунки в заданном порядке пропускают реагенты (dNTP, люциферин, аденозинфосфосульфат)

6 Технологии секвенирования 2 поколения: 454

Технологии секвенирования 2 поколения: 454

Платформа

GS Junior

GS FLX

Длина чтения

400

800

число чтений, М

0.1

1

Объем данных

35 Мб

700 Мб

цена за запуск/ цена за Мб (в $)

1 100/22

6 200/7

Время работы

10 часов

24 часа

Частота и тип ошибок

1% (индели)

1% (индели)

Преимущества: большая длина чтения (сравнимо с секвенированием по Сэнгеру) короткое время работы наименее чувствительна к GC-составу Недостатки неточность прочтения гомополимерных участков высокая цена в расчете на нуклеотид в 2016 году прекращается поддержка

7 Секвенирование Illumina: принцип метода

Секвенирование Illumina: принцип метода

1. ДНК фрагментируют и присоединяют к фрагментам адаптеры

3. Через ячейку пропускают реагенты для достраивания второй цепи ДНК

Стадии 3-4 повторяются 30-35 раз

6. Каждый фрагмент оказывается окружен группой идентичных молекул («кластеры»).

2. ДНК пропускают через каналы ячейки, покрытые праймерами, комплементарными концам адаптеров

4. Двуцепочечные фрагменты денатурируют

8 Секвенирование Illumina - принцип метода

Секвенирование Illumina - принцип метода

7. Через ячейку пропускают реагенты (флуоресцентно меченые терминированные dNTP и полимеразу)

8. На ячейку светят лазером и проводят съемку.

9. Через ячейку пропускают реагенты, отщепляющие флуорофор и терминатор

9 Illumina – приборы

Illumina – приборы

Самая распространенная из технологий NGS (~ 80% всех данных)

Платформа

HiSeq2000

HiSeq2500

MiSeq

Длина чтения

100+100

150+150

300+300

число чтений, М

4 000

600

15-25

объем данных, Гб

1 000

180

15

цена за запуск/цена за Мб (в $)

23 470/0.04

6 145/0.05

1600/0.14

Частота и тип ошибок

0.1% (замены)

0.1% (замены)

0.1-0.5% (замены)

Время работы

6 дней

40 часов

65 часов

HiSeq2000 и HiSeq2500 – модификации одного и того же прибора. MiSeq существует также в варианте MiSeqDx – первый NGS-прибор, разрешенный для использования в диагностике. В начале 2014 г. появились два новых прибора – NextSeq500 и HiSeqX 10

10 Illumina – преимущества и недостатки

Illumina – преимущества и недостатки

Преимущества: высокая точность универсальность доступность ПО для обработки и анализа результатов наименьшая цена получаемых данных (в расчете на нуклеотид)

Недостатки высокая цена реагентов проблемы с секвенированием матриц с низкой сложностью большая длительность прогона ошибки в GC-богатых участках

11 Полупроводниковое секвенирование

Полупроводниковое секвенирование

Самая новая из технологий cеквенирования 2 поколения

Сходно с 454-секвенированием, но регистрируется не свет, а pH

Платформа

Ion Torrent

Ion Proton

Длина чтения

До 400

200

число чтений, М

4-5.5

60-80

Объем данных

2 Гб

12-16 Гб

цена за запуск/цена за Мб (в $)

939/0.60

1 000/0.02

Частота и тип ошибок

0.5-2.5%

0.5-2.5%

Время работы

7 часов при длине 400

4 часа

Преимущества: относительно низкая цена за запуск быстрота Недостатки невысокая точность прочтения гомополимерных участков низкая производительность

12 Секвенирование путем лигирования (SOLiD)

Секвенирование путем лигирования (SOLiD)

Платформа

Solid 5500

Длина чтения

75+35, 60+60

число чтений, М

>1 400

Объем данных

150 Гб

цена за запуск/цена за Мб (в $)

10 503/0.07

Время работы

8 дней

Преимущества: высокая точность возможность использовать часть дорожек на ячейке Недостатки очень короткие чтения длительность работы относительно малая доступность свободного ПО

13 Секвенирование единичных молекул

Секвенирование единичных молекул

Helicos

простая пробоподготовка - фрагментация ДНК и аденилирование фрагментов. Затем фрагменты закрепляются на ячейке с олиго-dT принцип секвенирования сходен с Illumina – используются флуоресцентно меченые обратимо терминированные нуклеотиды (один тип нуклеотидов за цикл) небольшая (до 50 пн) длина чтения, много ошибок (3-5%)

Область применения – высокоточный анализ экспрессии, оценка копийности участков генома

14 Секвенирование единичных молекул

Секвенирование единичных молекул

Pacific Biosciences (SMRT sequencing)

Области применения – де ново сборка (в сочетании с Illumina для коррекции ошибок), анализ изоформ, поиск модифицированных оснований

Используется полимераза, иммобилизованная в 100-нм лунках, и флуоресцентно меченые dNTP. Возможны очень длинные чтения (> 10 000), но высокая частота ошибок (до 10%). Возможно прямое секвенирование метилированной ДНК, ведется работа над разработкой прямого секвенирования РНК.

15 Секвенирование единичных молекул

Секвенирование единичных молекул

Oxford Nanopore

Принцип основан на использовании мембран с белковыми нанопорами, через которые протягивается молекула ДНК. Секвенатор размером с USB-диск. Высокая скорость, очень высокая частота ошибок, низкая производительность (пока!)

16 Области применения NGS

Области применения NGS

What can next generation sequencing do for you?

секвенирование геномов и транскриптомов de novo отправная точка большинства молекулярно-биологических и генетических исследований на немодельных объектах, поиск крупных геномных перестроек полногеномное ресеквенирование поиск мутаций, ассоциированных с болезнями, картирование генов, геномы отдельных типов клеток, анализ древней ДНК направленное ресеквенирование биомедицина: скрининг мутаций с известной ролью в развитии болезней и поиск новых мутаций анализ транскриптома сравнение уровней экспрессии, поиск новых генов и изоформ, аннотация de novo секвенированных геномов ДНК-белковые и ДНК-ДНКовые взаимодействия поиск сайтов связывания транскрипционных факторов, изучение пространственной организации хроматина метагеномика анализ разнообразия микробных сообществ

17 Секвенирование геномов de novo: Amborella

Секвенирование геномов de novo: Amborella

18 Ngs и его применение в различных областях биологической науки
19 Анализ транскриптома: перенос РНК от хозяина к паразиту

Анализ транскриптома: перенос РНК от хозяина к паразиту

Kim et al. Genomic-scale exchange of mRNA between a parasitic plant and its hosts. Science 2014 345(6198):808-11.

20 Спасибо за внимание

Спасибо за внимание

21 Технологии секвенирования 2 поколения: области применения

Технологии секвенирования 2 поколения: области применения

Платформа/задача

454

Illumina

Ion Torrent/Proton

Solid

Секвенирование de novo

+++

+++

++ Для небольших геномов

-

Полногеномное ресеквенирование

-

+++

++ Для небольших геномов

++

Направленное ресеквенирование

+ Ампликоны

+++

+++

++

Анализ экспрессии

-

+++

++ Для небольших задач

++

ДНК-белковые взаимодействия (ChIP-seq) и т.д.

-

+++

++ Для небольших задач

++

Метагеномика анализ разнообразия микробных сообществ

+++ Особенно 16S

+++ Miseq – 16S, hiseq - полногеномное

+

-

22 Первое правило геномного секвенирования

Первое правило геномного секвенирования

Trash In - Trash Out

«Ngs и его применение в различных областях биологической науки»
http://900igr.net/prezentacija/biologija/ngs-i-ego-primenenie-v-razlichnykh-oblastjakh-biologicheskoj-nauki-191490.html
cсылка на страницу

Биосфера

15 презентаций о биосфере
Урок

Биология

136 тем
Слайды
900igr.net > Презентации по биологии > Биосфера > Ngs и его применение в различных областях биологической науки