Презентация на тему «Основы биотехнологии»

Основы биотехнологии

ТРАНСГЕНЕЗ. РАСТЕНИЯ Лекция 6

Словарь

Экспрессия гена – появление в клетках организма-реципиента биологически активного генного продукта Кассета экспрессии – фрагмент ДНК, содержащий все необходимые элементы (промотор, терминатор) для экспрессии внедренного в него гена

Причины внедрения в практику генетической инженерии растений

Техника трансгенеза

ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

Этапы получения трансгенных растений (до принятия решения об

интродукции)

ЭТАП 1. ПОЛУЧЕНИЕ И АМПЛИФИКАЦИЯ rДНК (кассета экспрессии+вектор)

ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

Кассета экспрессии

Промотор + целевой ген (трансген) + терминатор

Промоторы для кассеты экспрессии

Классификация

Конститутивные

Специфичные

Индуцибельные

Обеспечивают экспрессию на протяжении всего срока жизни трансгенного организма

Обеспечивают избирательную активность, например, экспрессию только в клубнях

Активируются под воздействием определенных факторов (хим. в-в, температуры и др.)

Векторы для переноса и интеграции кассеты экспрессии

Основа

Агробактериальная трансформация

Ti- и Ri-плазмиды

Этап 1.

1980 г. М. Ван Монтегю и Д. Шелл открыли явление агробактеральной

трансформации

Марк Ван Монтегю Джефф Шелл

Agrobacterium tumefaciens

http://www.sciencephoto.com/

Грамотрицательные аэробы, почвенные микроорганизмы, фитопатогены

http://commons.wikimedia.org

http://www.sciencedirect.com

Ti-плазмиды tumor-inducing, опухолеобразующие поражают наземную часть

растений

Найдены в agrobacterium tumefaciens – вызывающие образование у растений корончатых галлов, поражают, в основном, двудольные растения

Ri-плазмиды root-inducing, вызывают образование «бородатого» корня,

поражают ризосферу

найдены в Agrobacterium rhizogenes способны перемещаться в клетки корней высших растений, встраиваться в их ядерную ДНК и индуцировать избыточное разрастание корней

Механизм действия агробактерий

При повреждении клетки растения в почву попадают продукты обмена веществ – ацетосирингон и гидроацетосирингон Под их действием в плазмидах агробактерий активируются гены vir (вирулентности), обеспечивающие вырезание Т-ДНК (от англ. transferred, переносимый) из Ti-плазмиды В оболочке бактерии образуется разрыв, через который Т-ДНК переносится в растительную клетку Фланкирующие последовательности встраивают Т-ДНК в геном растительной клетки

Механизм действия агробактерий

В геноме растения Т-ДНК запускает синтез ферментов, необходимых для синтеза растительных гормонов: ауксина и цитокининов Гормоны действуют на клетки растения и вызывают местное разрастание тканей Включаются гены nos (нопалинсинтетазы), ферменты которых обеспечивают синтез в зараженных клетках опинов, которые Агробактерии используют как источник углеводов и азота

Ti-плазмиды

Структура.

Ауксины (индол-3-уксусная к-та) - формирование корней, побегов, индукция соматического эмбриогенеза и пр. Цитокинины (кинетин) – » – ингибируют образование корней Опины (нопалин) - производные аргинина

Размер от 200 т.п.н. до 800 т.п.н Основные элементы: Оri-область Vir-область Область Т-ДНК

Ti-плазмиды

Механизм действия

Ti-плазмиды

Вырезание Т-ДНК.

Перенос Т-ДНК в растительный геном

Т-ДНК встраиваются в разные, по-видимому случайные, точки хромосом, но никогда не интегрируют с ДНК митохондрий и хлоропластов

http://www.nature.com

Модификация Ti-плазмид для трансгенеза

Неонкогенная Ti-плазмида

удаляется область Т-ДНК добавляется сайт инициации репликации (ori) плазмиды Escherichia coli добавляются маркерные гены

Векторы для генетической трансформации растительных геномов

Бинарные векторы.

Бинарные

Содержат 2 сайта оri (для Е. соli и для A. tumefaciens), Т-ДНК, трансген Механизм действия: 1.вектор клонируют в Е. Соli 2.вектор переносят в A.tumefaciens, несущую неонкогенную Ti-плазмиду 3. трансгенез

Бинарный вектор

Репортер растений

Трансген

Ori E.coli

Репортер бактерий

Ori A.tumef.

http://www.sciencedirect.com

Векторы для генетической трансформации растительных геномов

Коинтегративные

Коинтегративные

Содержат ori Е. coli, Т-ДНК, фрагмент гомологичный Т-ДНК неонкогенной Ti-плазмиды Механизм действия: 1. вектор клонируют в E.coli 2. в Т-ДНК встраивают трансген и клонируют в E.coli 3. вектор переносят в A.tumefaciens с неонкогенной Ti-плазмидой 4.образуется рекомбинантная плазмида 5. трансгенез

http://www.znaytovar.ru/s/Texnologii_sozdaniya_gmrasteni.html

Векторы для генетической трансформации растительных геномов

Коинтегративные

http://www.sciencedirect.com

Использование агробактерий в трансгенезе растений

Недостаток системы агробактерий – это неспособ­ность трансформировать злаковые

опосредованный ДНК перенос генов

DMGT- векторы

Этап 1.

Dmgt-векторы (dna-mediated gene transfer)

Dmgt-векторы (dna-mediated gene transfer)

Вектор pBin 19 (11777 п.н.)

M13 R primer: AGG AAA CAG CTA TGA CCA T M13F primer: TGT AAA ACG ACG GCC AGT LB и RB – левая и правая границы cole1 ori – плазмида с в геном колицина E1 oriv – участок инициации репликации E.Coli

Этап 2. Выбор и подготовка растительных клеток-реципиентов для

трансгенеза

ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

Словарь

Тотипотентность – свойство клеток реализовать генетическую информацию ядра, обеспечивающую их дифференцировку, а также развитие до целого организма Каллус – травматическая меристема, состоит из дедифференцированных, делящихся клеток Суспензионная культура – культура соматических клеток, растущих в жидкой среде (глубинное культивирование) Протопласт – содержимое растительной клетки, лишенное клеточной стенки Меристемы – образовательные ткани, состоят из интенсивно делящихся клеток

При трансформации растений трансген может быть внесен:

В целые растений в клетки каллусной либо суспензионной культуры в интактные растительные клетки способные к вторичной регенерации в хлоропласты в протопласты в зародыши

Этап 3. Встраивание трансгена в геном растения (в клетку-реципиент)

ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

Способы внесения трансгена в клетки растений

Прямые методы

Опосредованные методы

Электропорация Микроинъекция Биобалистика Со-культивировние Инокуляция

При помощи векторов: Ti-плазмиды Ri-плазмиды Вирусы

МИКРОИНЪЕЦИЯ - генетическую конструкцию инъецируют в клетку

БИОБАЛЛИСТИКА - на е частички вольфрама, платины или золота, диаметром от 0,1 до 3,5 мкм, напыляется векторная ДНК, содержащая трансген. «Заряды» из пушки, пробивая мембраны, входят в цитоплазму и ядра клеток.

ЭЛЕКТРОПОРАЦИЯ - клеточные мембраны, становиться проницаемой для экзогенных молекул ДНК под действием импульсов высокого напряжения, за счет формирования временных пор, через которые способны проходить экзогенные молекулы

http://www.kkv5.pisem.net

БИОБАЛИСТИКА Общий вид и схема установки для биобаллистической

доставки генов в клетки растений. Particle Inflow Gun, (John Finer, Philip Vain et al. 1992)

36

Перенос трансгенов в растения

Прямой перенос генов

via Agrobacterium

Биобаллистика

Биобаллистика электропорация при помощи лазера

Инфильтрация

Инфильтрация микроинъекция со-культивирование

Меристемы стеблевых апексов

П р о т о п л а с т ы

при помощи ПЭГ электропорация микроинъекция при помощи липосом

Целое растение

З а р о д ы ш и

Культивируемые in vitro клетки, компетентные к регенерации

Биобаллистика

Микроинъекция со-культивирование

Культивируемые in vitro клетки, компетентные к регенерации

Микроинъекция со-культивирование

Метод

Использование Ti-плазмид

Бомбардировка микрочастицами

Использование векторов на основе вирусов

Микроинъекции

Электропорация

Слияние липосом

Прямое введение генов в протопласты

Эффективность применения и перспективы использования

Высокоэффективная система. Применима не для всех видов растений

Высокоэффективная система. Может использоваться для широкого круга растений и тканей

Неэффективный способ доставки ДНК в растительные клетки

Применение ограничивается тем, что инъекция одновременно может быть сделана только в одну клетку

Применение возможно для введения генов в протопласты

— « —

— « —

Этап 4. Отбор трансформированных клеток, растений

ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

Ti-плазмиды

Механизм действия

Alternative selection system based on the phosphomannose isomerase

gene

41

Протокол трансформации пшеницы: сочетание селекции на фосфинотрицине

(РРТ) с визуальной селекцией по экспрессии гена gfp

Молодые колосья

3.5 мес

Индукция эмбриогенеза

Внедрение в практику

ТРАНСГЕНЕЗ РАСТЕНИЯ. Лекция 6

Предмет биотехнологии растений

Генетическая трансформация растений – позволяет создавать растения: а) устойчивые к биотическим и абиотическим стрессам б) с улучшенными технологическими и питательными свойствами в) производящие вакцины, полимеры (пластик и каучук), топливо и смазочные материалы

Контроль трансгенное

Устойчивость трансгенного табака с геном bt к личинкам непарного шелкопряда

48

www.meristema.info

49

Контроль клон 2 клон 1