Нуклеиновые кислоты
<<  Биологические полимеры- нуклеиновые кислоты Нуклеиновые кислоты и их роль в жизнедеятельности клетки  >>
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Источник тока
Источник тока
Enzyme
Enzyme
Буферные растворы
Буферные растворы
Aor13HI
Aor13HI
Рестрикционные карты
Рестрикционные карты
Рестрикционные карты
Рестрикционные карты
?
?
План работ
План работ
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Лаборатория биотехнологии
Лаборатория биотехнологии
План работ
План работ
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле
lg m=lg m0 - Krt
lg m=lg m0 - Krt
Зависимость концентрации агарозного геля от длинны ДНК и вида буфера
Зависимость концентрации агарозного геля от длинны ДНК и вида буфера
План работ
План работ
План работ
План работ
План работ
План работ
План работ
План работ
21 октября Измерение концентрации ДНК ПЦР Форез
21 октября Измерение концентрации ДНК ПЦР Форез
Спектрофотометрия препаратов днк, рнк и белков
Спектрофотометрия препаратов днк, рнк и белков
Все о электрофорезе ДНК в агарозном геле
Все о электрофорезе ДНК в агарозном геле
?????
?????
Электрофорез
Электрофорез
Электрофорез
Электрофорез
Гель должен быть закрыт слоем буфера в 1мм
Гель должен быть закрыт слоем буфера в 1мм
Электрофорез
Электрофорез
Размер молекул ДНК
Размер молекул ДНК
Состав оснований и температура
Состав оснований и температура
Напряженность электрического поля
Напряженность электрического поля
Концентрация агарозы
Концентрация агарозы
Зависимость концентрации агарозного геля от длинны ДНК
Зависимость концентрации агарозного геля от длинны ДНК
Типы агароз
Типы агароз
Маркеры
Маркеры
Окраска ДНК в агарозных гелях
Окраска ДНК в агарозных гелях
Бромистый этидий сильный канцероген, поэтому все операции с ним
Бромистый этидий сильный канцероген, поэтому все операции с ним
Окраска бромистым этидием (EtBr)
Окраска бромистым этидием (EtBr)
Буфер для образцов
Буфер для образцов
Буфер для образцов
Буфер для образцов
Буфер для образцов
Буфер для образцов
Буфер для образцов
Буфер для образцов
Минусы:
Минусы:
Электродный буферный раствор
Электродный буферный раствор
Видео
Видео
Видео
Видео
Электрофорез ДНК в акриламиде
Электрофорез ДНК в акриламиде
Капиллярный электрофорез
Капиллярный электрофорез
Все о рестриктазах
Все о рестриктазах
Видео
Видео
Рестрикция
Рестрикция
Система рестрикции-модификации ферментативная система бактерий,
Система рестрикции-модификации ферментативная система бактерий,
Одной из первой открытой рестриктазой была HindII
Одной из первой открытой рестриктазой была HindII
Классификация рестриктаз
Классификация рестриктаз
В практической молекулярной биологии чаще всего используются
В практической молекулярной биологии чаще всего используются
5’
5’
5’
5’
Палиндром (от греч
Палиндром (от греч
Примеры полиндромов
Примеры полиндромов
Примеры полиндромов
Примеры полиндромов
Названия рестриктазам даются по следующему принципу: род
Названия рестриктазам даются по следующему принципу: род
Буферные растворы
Буферные растворы
Усливия работы рестриктаз
Усливия работы рестриктаз
Общий объем рестриктазы не более 1/10 объёма реакционной смеси
Общий объем рестриктазы не более 1/10 объёма реакционной смеси
Некоторые рестриктазы при работе в неоптимальных условиях могут менять
Некоторые рестриктазы при работе в неоптимальных условиях могут менять
Изомеры
Изомеры
Гетерошизомеры (неошизомеры)
Гетерошизомеры (неошизомеры)
Изокаудомеры
Изокаудомеры
Тупые и липкие концы
Тупые и липкие концы
Тупые и липкие концы
Тупые и липкие концы
Крупно- и мелкощепящие рестриктазы
Крупно- и мелкощепящие рестриктазы
Единицы активности рестриктазы
Единицы активности рестриктазы
Рестрикционные карты
Рестрикционные карты
Задача на составление рестрикционных карт
Задача на составление рестрикционных карт
A
A
Задача на составление рестрикционных карт
Задача на составление рестрикционных карт
Спасибо за внимание
Спасибо за внимание

Презентация: «Электрофорез ДНК в агарозном геле». Автор: Дети. Файл: «Электрофорез ДНК в агарозном геле.ppt». Размер zip-архива: 8564 КБ.

Электрофорез ДНК в агарозном геле

содержание презентации «Электрофорез ДНК в агарозном геле.ppt»
СлайдТекст
1 Электрофорез ДНК в агарозном геле

Электрофорез ДНК в агарозном геле

2 Электрофорез ДНК в агарозном геле

Электрофорез ДНК в агарозном геле

Катод? Анод?

3 Электрофорез ДНК в агарозном геле

Электрофорез ДНК в агарозном геле

Катод? Анод?

Анод — электрически положительный полюс катод — электрически отрицательный полюс

4 Электрофорез ДНК в агарозном геле

Электрофорез ДНК в агарозном геле

Катод? Анод?

Анод — электрически положительный полюс катод — электрически отрицательный полюс

Куда движется ДНК? Как она заряжена?

5 Электрофорез ДНК в агарозном геле

Электрофорез ДНК в агарозном геле

Катод? Анод?

Анод — электрически положительный полюс катод — электрически отрицательный полюс

Куда движется ДНК? Как она заряжена?

Благодаря заряду фосфатных групп, ДНК имеет отрицательный заряд.

6 Электрофорез ДНК в агарозном геле

Электрофорез ДНК в агарозном геле

Электрофорез (от электро- и др.-греч. ????? — «переношу») — направленное движение коллоидных частиц или ионов под действием электрического тока

Куда движется ДНК? Как она заряжена?

Благодаря заряду фосфатных групп, ДНК имеет отрицательный заряд.

Анод — электрически положительный полюс катод — электрически отрицательный полюс

Катод? Анод?

7 Источник тока

Источник тока

Вольтаж

Сила тока – А Напряжение – V Сопротивление – R

закон Ома:

8 Enzyme

Enzyme

Enzyme

Enzyme

Enzyme

Cat#

Cat#

Temp

Temp

Supplied NEBuffer

Supplied NEBuffer

Supplements

Supplements

% Activity in NEBuffer

% Activity in NEBuffer

% Activity in NEBuffer

% Activity in NEBuffer

% Activity in NEBuffer

BSA

SAM

1

2

3

4

EcoRI

BamHI*

R0136

37°C

NEBuffer 3

Yes

No

75

100

100

100

100

MluI

R0198

37°C

NEBuffer 3

No

No

25

75

100

50

100

9 Буферные растворы

Буферные растворы

Enzyme

Enzyme

Enzyme

Enzyme

Cat#

Cat#

Temp

Temp

Supplied NEBuffer

Supplied NEBuffer

Supplements

Supplements

% Activity in NEBuffer

% Activity in NEBuffer

% Activity in NEBuffer

% Activity in NEBuffer

% Activity in NEBuffer

BSA

SAM

1

2

3

4

EcoRI

AciI

R0551

37°C

NEBuffer 3

No

No

25

50

100

50

100

ApaI

R0114

25°C

NEBuffer 4

Yes

No

25

50

0

100

5

10 Aor13HI

Aor13HI

T/CCGGA

BspEI

R0540

T/CCGGA

AccIII, BseAI, Bsp13I, BspEI, Kpn2I, MroI

11 Рестрикционные карты

Рестрикционные карты

EcoR

EcoR

600bp

5’

3’

3’

5’

12 Рестрикционные карты

Рестрикционные карты

EcoR

EcoR

600bp

5’

3’

3’

5’

NcoI

BamH1

200bp

13 ?

?

П.Н.

Длина ожидаемого фрагмента 700 пн

Результат ПЦР от 03.12.13

Амплифицировали кДНК одноцепочечного антитела при помощи ПЦР (одноцепочечное антитело состоит из вариабельных участков тяжелой и легкой цепей)

3000

2500

2000

1500

1000

750

500

250

14 План работ

План работ

Получение (выделение) нужного нам гена Линеаризация вектора Лигирование (встраивание) гена в вектор Приготовление компетентных клеток Электропорация (внедрение) вектора с нашим геном в компетентные клетки Синтез и выделение белка

15 Электрофорез ДНК в агарозном геле
16 Лаборатория биотехнологии

Лаборатория биотехнологии

ФГБУН Институт экологии человека Сибирского отделения Российской академии наук

Кемерово

2014

17 План работ

План работ

Выделение и очистка ДНК ПЦР Рестрикция вектора Лигирование - сшивание гена с вектором Электропорация (внедрение) вектора с геном в компетентные клетки Экспрессия белка Выделение и очистка белка

Вектор для наработки ДНК

Выделение и очистка ДНК

ПЦР ферментативное копирование фрагмента ДНК

18 Электрофорез ДНК в агарозном геле
19 lg m=lg m0 - Krt

lg m=lg m0 - Krt

20 Зависимость концентрации агарозного геля от длинны ДНК и вида буфера

Зависимость концентрации агарозного геля от длинны ДНК и вида буфера

21 План работ

План работ

Выделение и очистка ДНК ПЦР Рестрикция вектора Лигирование - сшивание гена с вектором Электропорация (внедрение) вектора с геном в компетентные клетки Экспрессия белка Выделение и очистка белка

Вектор для наработки ДНК

Выделение и очистка ДНК

ПЦР ферментативное копирование фрагмента ДНК

22 План работ

План работ

Выделение и очистка ДНК ПЦР Рестрикция вектора Лигирование - сшивание гена с вектором Электропорация (внедрение) вектора с геном в компетентные клетки Экспрессия белка Выделение и очистка белка

Вектор для экспрессии белка

Линеаризация вектора разрезание рестриктазами

Сшивании вектора с геном реакция лигирования

23 План работ

План работ

Выделение и очистка ДНК ПЦР Рестрикция вектора Лигирование - сшивание гена с вектором Электропорация (внедрение) вектора с геном в компетентные клетки Экспрессия белка Выделение и очистка белка

Трансфекция введения ДНК в бактериальную клетку

Методом электропорации

24 План работ

План работ

Выделение и очистка ДНК ПЦР Рестрикция вектора Лигирование - сшивание гена с вектором Электропорация (внедрение) вектора с геном в компетентные клетки Экспрессия белка Выделение и очистка белка

Экспрессия белка Создание условий для наработки белка

Выделение и очистка белка

Готовый белковый продукт

25 21 октября Измерение концентрации ДНК ПЦР Форез

21 октября Измерение концентрации ДНК ПЦР Форез

10:00-11:00 – лекция 11:00-13:00 – определение концентрации выделенной ДНК 13:00-13:30 – обед 13:30-14:00 – ПЦР 14:00-15:00 – лекция 15:00-16:00 – форез

26 Спектрофотометрия препаратов днк, рнк и белков

Спектрофотометрия препаратов днк, рнк и белков

Спектрофотометрия – физико-химический метод исследования растворов и твердых веществ, основанный на изучении поглощения в различных областях спектра.

С помощью спектрофотометра можно точно и быстро определить концентрацию ДНК, а также степень ее чистоты. Для этого измеряют оптическую плотность раствора ДНК при длине волны 260 нм. А для оценки чистоты препарата ДНК, проводят измерения оптической плотности раствора еще и при 280 и 235 нм, т.е. на максимумах поглощения растворов белков и полисахаридов, соответственно. Значение соотношения А260/280 для чистой ДНК должно быть больше 1,8, значение А260/235 должно быть больше, чем 2,2. Одна (каждая) оптическая единица соответствует концентрации: dsDNA (двуцепочечная ДНК) в 50 мкг/мл ssDNA (одноцепочечная ДНК) в 37 мкг/мл ssRNA (одноцепочечная РНК) в 40 мкг/мл Нижний предел концентрации ДНК, которую можно определить спектрофотометрически, составляет 0,1 мкг/мл.

27 Все о электрофорезе ДНК в агарозном геле

Все о электрофорезе ДНК в агарозном геле

28 ?????

?????

Электрофорез ДНК в агарозном геле

Электрофорез (от электро- и др.-греч. ????? — «переношу») — направленное движение коллоидных частиц или ионов в жидкой среде под действием электрического поля

Катод

Анод

Впервые это явление было открыто профессорами Московского университета П.А. Страховым и Ф.Ф. Рейссом в 1809 году.

Куда движется ДНК?

Как она заряжена?

Благодаря суммарному заряду всех фосфатных групп, ДНК имеет большой отрицательный заряд.

В протонной теории кислот и оснований Брёнстеда — Лоури, кислотой называется соединение или ион, способное отдавать протон другому химическому соединению — основанию.

Отрицательно заряженный электрод

Положительно заряженный электрод

29 Электрофорез

Электрофорез

Электрофорез в агарозном геле является стандартным методом для разделения, идентификации и очистки молекул ДНК и их фрагментов

30 Электрофорез

Электрофорез

Камера для проведения горизонтального фореза

Подложка для геля

Агарозный гель

Буферный раствор

Электроды

(Гель должен быть закрыт слоем буфера толщиной 1 мм)

Всегда помните, что ДНК бежит от «-» к «+», от черного электрода к красному

31 Гель должен быть закрыт слоем буфера в 1мм

Гель должен быть закрыт слоем буфера в 1мм

Электрофорез

Камера для проведения горизонтального фореза

Подложка для геля

Агарозный гель

Буферный раствор

Электроды

32 Электрофорез

Электрофорез

Скорость миграции ДНК через поры агарозного геля называется электрофоретической подвижностью и определяется несколькими параметрами

33 Размер молекул ДНК

Размер молекул ДНК

Чем больше размер, тем меньше электрофоретическая подвижность, крупные молекулы движутся медленнее из-за большего сопротивления

Скорость обратно пропорциональна десятичному логарифму молекулярной массы (Mw) ДНК

Конформация ДНК

Кольцевая неповрежденная – форма I

Кольцевая с одноцепочечным разрывом – форма II

Линейная – форма III

34 Состав оснований и температура

Состав оснований и температура

Электрофоретическая подвижность в агарозном геле практически не зависит от состава оснований

В области температур 4 – 30 °С изменения подвижности ДНК не наблюдаются

Напряженность электрического поля

Это сила, действующая на точечный заряд, помещенный в данную точку поля

Единицы измерения: В/см

Напряженность ЭП для электрофореза обычно составляет 1 – 8 В/см наилучшее разделение при 5 В/см

При более высокой напряженности могут изогнуться полосы ДНК или расплавится небольшие фрагменты ДНК

35 Напряженность электрического поля

Напряженность электрического поля

Источник тока

Изменяемые параметры

Могут работают в двух режимах: Постоянное напряжение Постоянная сила тока

Напряжение – U (Volt) или Сила тока – I (Amper) Закон Ома: I = U / R

V=A x R

A=V / R

36 Концентрация агарозы

Концентрация агарозы

Агароза — линейный полисахарид, получаемый из агара, образованный из чередующихся остатков ?-D-галактопиранозы и 3,6-ангидридо-?-1-галактопиранозы, объединённых 1?4 связью. Обладает ярко выраженным свойством к формированию гелей.

Точка плавления ? 95 °C Точка образования геля ? 45 °C Гель является термообратимым

37 Зависимость концентрации агарозного геля от длинны ДНК

Зависимость концентрации агарозного геля от длинны ДНК

Зная размеры молекул ДНК в смеси, можно подбором концентрации добиться их наилучшего разделения

Манипуляция с агарозой менее 1% только при +60С!!!!

% Агарозы

0.3

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.2

1.5

2.0

3.0

4.0

Размер DNA

5–60 kbp

1–30 kbp

1–20 kbp

800bp –12 kbp

600 bp –10 kbp

500 bp –8 kbp

500 bp –7 kbp

400bp –6 kbp

200bp –3 kbp

100 bp –2 kbp

40 bp –2 kbp

10 bp – 400 bp

38 Типы агароз

Типы агароз

Легкоплавкая агароза: плавится при 600С. Форез ведут при +60С.

39 Маркеры

Маркеры

Представляет собой смесь ДНК фрагментов известной длины (молекулярного веса) пригодных для использования в качестве стандарта молекулярных весов в электрофорезе.

ДНК маркер не предназначен для определения количества ДНК, однако может быть использован для приблизительной оценки путем сравнения интенсивности окрашивания фрагментов одинаковой длины.

100bp +15kb +3kb

50kb

1kb

40 Окраска ДНК в агарозных гелях

Окраска ДНК в агарозных гелях

Для визуализации ДНК применяют флюоресцирующий интеркалирующий краситель – бромистый этидий (EtBr)

3,8-диамино-5-этил-6-фенил-фенантридиум бромид

Молекулы красителя интеркалируют (встраиваются) между соседними парами нуклеотидов ДНК.

Максимум поглощения EtBr наблюдается при длинах волн 300 и 360 нм (УФ-излучение), а эмиссия происходит в красно-оранжевой области видимого спектра при 590 нм

41 Бромистый этидий сильный канцероген, поэтому все операции с ним

Бромистый этидий сильный канцероген, поэтому все операции с ним

ромистый этидий сильный канцероген, поэтому все операции с ним следует проводить в перчатках!!!!!!!!!!!!!!!

Окраска бромистым этидием (EtBr)

При связывании с ДНК интенсивность флюоресценции EtBr увеличивается в 20 раз и обеспечивает высокую чувствительность: от 10 нг ДНК

Интенсивность свечения зависит от размера ДНК: чем длиннее молекула, тем интенсивнее окраска.

42 Окраска бромистым этидием (EtBr)

Окраска бромистым этидием (EtBr)

Два способа окрашивания бромистым этидием:

Сразу добавлять в расплавленную агарозу. – EtBr заряжен положительно, мигрирует к катоду – тем самым несколько замедляя продвижение ДНК – необходимость добавления и в электродный буфер – больше «грязи» + лучше разрешение + в целом, электрофорез проходит быстрее

Гель окрашивают после электрофореза в растворе содержащим EtBr. – дольше, так как часто требуется еще и отмывка от этидия – хуже разрешение + менеше «грязи» – менее ядовито ?

Рабочая концентрация бромистого этидия – 0,1-0.5 мкг/мл Везде одинаковая и в геле и в буфере и в красящем растворе Обычно готовят стандартный (стоковый) 20000x кратный раствор 1 г EtBr разводят в 100 мл дистиллированной воды. Стоковая концентрация 10 мг/мл.

43 Буфер для образцов

Буфер для образцов

Состав буфер для образцов:

10x кратный стоковый раствор 50% глицерин или 70% сахароза или 25% фикол 0.25% бромфеноловый синий и/или 0.25% ксилен цианол 1x TAE буфер

1. “Утежелитель” – в увеличивает плотность раствора, для того чтобы образцы сразу опускаются на дно лунки

Рабочая концентрация “утежелителя”: - глицерин: 6-10 % - сахароза: 6-7 % - фикол: 2,5 %

44 Буфер для образцов

Буфер для образцов

Состав буфер для образцов:

10x кратный стоковый раствор 50% глицерин и/или 70% сахароза и/или 25% фикол 0.25% бромфеноловый синий и/или 0.25% ксилен цианол 1x TAE буфер

2. Краситель

* облегчает внесение образцов в лунку; * Заряжен “–”, движется в том же направлении, что и ДНК * позволяет иметь представление, на каком этапе сейчас электрофорез; * может мешать наблюдению фрагментов под UV; * может оказаться нежелательной примесью при элюции фрагмента из геля.

45 Буфер для образцов

Буфер для образцов

Красители тоже имеют различную электрофоретическую подвижность

Ксилен цианол

Бромфеноловый синий

46 Буфер для образцов

Буфер для образцов

Красители тоже имеют различную электрофоретическую подвижность

Ксилен цианол

Бром феноловый синий

47 Минусы:

Минусы:

Хуже разрешение

Невозможно дальше выделять и использовать образцы

Лигирование

Электродный буферный раствор

TAE: 1x Трис-ацетат-ЭДТА 40 мМ Трис (рН 7,6), 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА 50x стоковый (1 литр) - растворить в 600 мл дистиллированной воды: 242 г Трис основной (FW = 121) 57,1 мл ледяной уксусной кислоты 100 мл 0,5 М EDTA (рН 8,0). Довести до конечного объема 1 л дистиллированной водой.

TBE: 1x Трис-борат-ЭДТА (TBE) 89 мМ Трис (рН 7,6), 89 мМ борной кислоты, 2 мМ ЭДТА 5x стоковый (1 литр) - растворить в 600 мл дистиллированной воды: 54 г Трис основной (FW = 121) 27,5 г борной кислоты (FW = 61,8) 20 мл 0,5 М EDTA (рН 8,0) Довести до конечного объема 1 л дистиллированной водой.

48 Электродный буферный раствор

Электродный буферный раствор

Исторически сложилось так, что TAE используют чаще других буферных р-рв

Минусы:

TAE:

Хуже разрешение Низкая буферная емкость – при длительных эл.форезах происходит истощение буфера

TBE:

Невозможно дальше выделять и использовать образцы, т.к. борная кислота ингибирует многие ферментативные реакции

Лигирование

49 Видео

Видео

50 Видео

Видео

51 Электрофорез ДНК в акриламиде

Электрофорез ДНК в акриламиде

52 Капиллярный электрофорез

Капиллярный электрофорез

В 1960х годах была предложена методика капиллярного электрофореза для разделения молекул по заряду и размеру в тонком капилляре, заполненном электролитом.

Основное отличие от классического элетрофореза: используется специальный электролит, а не гель

Используется при секвенировании ДНК

Детектирование разделившихся молекул при капиллярном электрофорезе осуществляется специальными устройствами

Капилляр с электролитом

Детектор

Буфер 1 + Образец

Буфер 2

53 Все о рестриктазах

Все о рестриктазах

54 Видео

Видео

55 Рестрикция

Рестрикция

Рестриктазы (рестрицирующие эндонуклеазы, эндонуклеазы рестрикции)

Класс гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.

56 Система рестрикции-модификации ферментативная система бактерий,

Система рестрикции-модификации ферментативная система бактерий,

истема рестрикции-модификации ферментативная система бактерий, разрушающая попавшую в клетку чужеродную ДНК. Основная её функция — защита клетки от чужеродного генетического материала, например, бактериофагов и плазмид. Для компонентов системы характерны два типа активности —метилтрансферазная (метилазная) и эндонуклеазная. За каждую из них могут отвечать как отдельные белки, так и один белок, сочетающий в себе обе функции. Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина (маскированием)

57 Одной из первой открытой рестриктазой была HindII

Одной из первой открытой рестриктазой была HindII

В 1978 году Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине «За обнаружение рестрикционных ферментов и их применение в молекулярной генетике».

К 2007 году выделено более трех тысяч эндонуклеаз рестрикции

58 Классификация рестриктаз

Классификация рестриктаз

Рестриктазы первого типа (ЕсоК из Escherichia coli К12) узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочную молекулу ДНК неподалёку от этой последовательности в произвольной точке и само место разреза не строго специально (по-видимому, после образования комплекса с ДНК фермент неспецифически взаимодействует с удаленной областью ДНК или передвигается вдоль цепи ДНК). Рестриктазы второго типа (например, EcoRI) узнают определённую последовательность и разрезают двойную спираль ДНК в определённой фиксированной точке внутри этой последовательности. Рестриктазы этого типа узнают палиндромальные последовательности, которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии. Рестриктазы третьего (промежуточного) типа (например, EcoPI) узнают нужную последовательность и разрезают двухцепочную молекулу ДНК, отступив определённое число нуклеотидных пар от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). Эти рестриктазы узнают асимметричные сайты.

При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5'- или 3'-концами.

59 В практической молекулярной биологии чаще всего используются

В практической молекулярной биологии чаще всего используются

рестриктазы II типа, сайт узнавания для которых в большинстве случаев представляет собой палиндром.

Палиндром

Палиндром буквосочетание, слово или текст, одинаково читающееся в обоих направлениях. Иногда палиндромом неформально называют любой симметричный относительно своей середины набор символов.

5’

GAA TTC

3’

3’

CTT AAG

5’

60 5’

5’

GAA TTC

3’

3’

CTT AAG

5’

A

A

T

C

G

T

C

T

A

G

T

A

5’

GAA TTC

3’

3’

CTT AAG

5’

61 5’

5’

3’

62 Палиндром (от греч

Палиндром (от греч

алиндром (от греч. ????? — «назад, снова» и греч. ?????? — «бег»), иногда также палиндромон, от гр. palindromos бегущий обратно)

число (например, 404), слово (например, топот или ротор текст (например, а роза упала на лапу Азора) одинаково читающееся в обоих направлениях

Отдельные палиндромические словосочетания и фразы известны с глубокой древности, когда им зачастую придавался магически-сакральный смысл

63 Примеры полиндромов

Примеры полиндромов

Ох и тихо!

Яд, яд, дядя!

Яд ем как мед я!

И лежу. Ужели?

Гори, печурка, - круче пирог!

Тут хорош сыр, крыс шорох тут.

Магический квадрат с фразой SATOR AREPO TENET OPERA ROTAS (лат. Сеятель Арепо с трудом держит колеса), читаемой во всех направлениях

64 Примеры полиндромов

Примеры полиндромов

Музыкальные произведения:

"Путь Мира" - Игнац Мошелес

"Застольная мелодия для двоих" - Моцарт

65 Названия рестриктазам даются по следующему принципу: род

Названия рестриктазам даются по следующему принципу: род

микроорганизма обозначается первой прописной буквой EcoR I – Escherichia BamH I – Bacillus вид — двумя строчными EcoR I – coli BamH I – amyloliquefaciens иногда указывают штамм в виде заглавной буквы EcoR I – RY13 BamH I – H1 Римские цифры — это порядковый номер данной эндонуклеазы в ряду прочих рестриктаз, выделенных из данного микроорганизма EcoR I BamH I Например, Hра I и Нра II — соответственно первая и вторая рестрицирующие эндонуклеазы II типа, выделенные из Haemophilus parainfluenzae.

66 Буферные растворы

Буферные растворы

Рестриктазы являются ферментами, активность которых зависит от состава реакционной смеси и температуры проведения реакции.

Se-буфер B

10 mm tris-hcl (ph 7.6 при 25°C); 10 mm mgcl2; 1 mm DTT.

Se-буфер G

10 mm tris-hcl (ph 7.6 при 25°C); 10 mm mgcl2; 50 mm nacl; 1 mm DTT.

Se-буфер O

50 mm tris-hcl (ph 7.6 при 25°C); 10 mm mgcl2; 100 mm nacl; 1 mm DTT.

Se-буфер W

10 mm tris-hcl (ph 8.5 при 25°C); 10 mm mgcl2; 100 mm nacl; 1 mm DTT.

Se-буфер 2W

20 mm tris-hcl (ph 8,5 при 25°C); 10 mm mgcl2;; 200 mm nacl; 1 mm DTT

Se-буфер Y

33 mm tris-ацетат (ph 7.9 при 25°C); 10 mm магний-ацетат; 66 mm калий-ацетат; 1 mm DTT.

Se-буфер ecori

100 mm tris-hcl (ph 7.6 при 25°C); 10 mm mgcl2; 50 mm nacl; 1 mm DTT.

Фермент

Фермент

Сайт узнавания

Сайт узнавания

Оптим. буфер

Оптим. буфер

BSA

BSA

Активность (в % от максимальной)

Активность (в % от максимальной)

Активность (в % от максимальной)

Активность (в % от максимальной)

Активность (в % от максимальной)

Активность (в % от максимальной)

Оптимальная температура, °С

Оптимальная температура, °С

Инактивация, °С

Инактивация, °С

B

G

O

W

Y

R

BamH I *

BamH I *

G?GATCC

G

G

+

+

25 - 50

25 - 50

100

100

75 - 100

75 - 100

75 - 100

75 - 100

25 - 50

25 - 50

100

100

37

37

65

65

CCTAG?G

Bsp19 I

Bsp19 I

C?CATGG

2W

2W

+

+

0 - 10

0 - 10

10 - 25

10 - 25

50 - 75

50 - 75

75 - 100

75 - 100

10 - 25

10 - 25

5

5

37

37

65

65

GGTAC?C

EcoR I

EcoR I

G?AATTC

*

*

+

+

50 - 75

50 - 75

75 - 100

75 - 100

75 - 100

75 - 100

75 - 100

75 - 100

50 - 75

50 - 75

50

50

37

37

65

65

CTTAA?G

Hind III

Hind III

A?AGCTT

W

W

+

+

10 - 25

10 - 25

25 - 50

25 - 50

0 - 10

0 - 10

100

100

0 - 10

0 - 10

100

100

37

37

80

80

TTCGA?A

Kpn I

Kpn I

GGTAC?C

B

B

+

+

100

100

25 - 50

25 - 50

25 - 50

25 - 50

25 - 50

25 - 50

75 - 100

75 - 100

50

50

37

37

80

80

C?CATGG

Pst I

Pst I

CTGCA?G

O

O

+

+

10 - 25

10 - 25

25 - 50

25 - 50

100

100

25 - 50

25 - 50

25 - 50

25 - 50

50

50

37

37

80

80

G?ACGTC

Sma I

Sma I

CCC?GGG

Y

Y

-

-

0 - 10

0 - 10

0 - 10

0 - 10

0 - 10

0 - 10

0 - 10

0 - 10

100

100

50

50

25

25

65

65

GGG?CCC

67 Усливия работы рестриктаз

Усливия работы рестриктаз

Инактивация

Длительность работы: От 1 часа до 12 часов

Длительность и температура тоже различные, но не ниже 65 ° С

Оптимальная температура различная, чаще всего 37 ° С, но бывают и исключения: Sma I +25° С Bcl I +50° С BsaB I +60° С Bsm I +65° С

Фермент

Фермент

Сайт узнавания

Сайт узнавания

Оптим. буфер

Оптим. буфер

BSA

BSA

Активность (в % от максимальной)

Активность (в % от максимальной)

Активность (в % от максимальной)

Активность (в % от максимальной)

Активность (в % от максимальной)

Активность (в % от максимальной)

Оптимальная температура, °С

Оптимальная температура, °С

Инактивация, °С

Инактивация, °С

B

G

O

W

Y

R

BamH I *

BamH I *

G?GATCC

G

G

+

+

25 - 50

25 - 50

100

100

75 - 100

75 - 100

75 - 100

75 - 100

25 - 50

25 - 50

100

100

37

37

65

65

CCTAG?G

Bsp19 I

Bsp19 I

C?CATGG

2W

2W

+

+

0 - 10

0 - 10

10 - 25

10 - 25

50 - 75

50 - 75

75 - 100

75 - 100

10 - 25

10 - 25

5

5

37

37

65

65

GGTAC?C

EcoR I

EcoR I

G?AATTC

*

*

+

+

50 - 75

50 - 75

75 - 100

75 - 100

75 - 100

75 - 100

75 - 100

75 - 100

50 - 75

50 - 75

50

50

37

37

65

65

CTTAA?G

Hind III

Hind III

A?AGCTT

W

W

+

+

10 - 25

10 - 25

25 - 50

25 - 50

0 - 10

0 - 10

100

100

0 - 10

0 - 10

100

100

37

37

80

80

TTCGA?A

Kpn I

Kpn I

GGTAC?C

B

B

+

+

100

100

25 - 50

25 - 50

25 - 50

25 - 50

25 - 50

25 - 50

75 - 100

75 - 100

50

50

37

37

80

80

C?CATGG

Pst I

Pst I

CTGCA?G

O

O

+

+

10 - 25

10 - 25

25 - 50

25 - 50

100

100

25 - 50

25 - 50

25 - 50

25 - 50

50

50

37

37

80

80

G?ACGTC

Sma I

Sma I

CCC?GGG

Y

Y

-

-

0 - 10

0 - 10

0 - 10

0 - 10

0 - 10

0 - 10

0 - 10

0 - 10

100

100

50

50

25

25

65

65

GGG?CCC

68 Общий объем рестриктазы не более 1/10 объёма реакционной смеси

Общий объем рестриктазы не более 1/10 объёма реакционной смеси

глицирин, входящий в состав буфера для хранения фермента, может ингибировать реакцию

Усливия работы рестриктаз

Все рестриктазы — Mg2+-зависимы. Буферные растворы должны содержать этот ион.

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С (оптимальной температуре для данного фермента рестрикции ) в 50 мкл реакционной смеси.

69 Некоторые рестриктазы при работе в неоптимальных условиях могут менять

Некоторые рестриктазы при работе в неоптимальных условиях могут менять

свою специфичность. Это называется Star-активностью и отмечается звёздочкой (*).

Например, EcoRI при повышении рН и уменьшении ионной силы буфера вместо последовательности 5’- G AATTC -3’ узнаёт последовательность 5’- N AATTN -3’.

Star-активность *

70 Изомеры

Изомеры

Классификации рестриктаз

Изошизомеры Гетерошизомеры (неошизомеры) Изокаудомеры

Изошизомеры — это пары эндонуклеаз рестрикции, имеющих специфичность к распознаванию одинаковых последовательностей, разрезающих эти последовательности в одинаковых местах.

Первый выделенный фермент для узнавания и специфического разрезания заданной последовательности, называют прототипом, а все остальные подобные рестриктазы называют изошизомерами.

Примеры:

Sph I CGTAC^G

NcoI C^CATGG

XapI Y^GGCCR

NdeII ^GATC

Bbu I CGTAC^G

Bsp19I C^CATGG

AcsI Y^GGCCR

BstKTI^ ^GATC

BstMBI ^GATC

Kzo9I ^GATC

71 Гетерошизомеры (неошизомеры)

Гетерошизомеры (неошизомеры)

Фермент, узнающий такую же последовательность, но разрезающий её по-другому, называют гетерошизомером (неошизомером). Изошизомеры, таким образом, являются частным случаем гетерошизомеров

Примеры:

GGGCCC

Sma I GGG^CCC

Xma I G^GGCCC

72 Изокаудомеры

Изокаудомеры

Рестриктазы, распознающие совершенно разные последовательности, но образующие одинаковые концы, называют изокаудомерами

Mbo I N*GATC N N CTAG*N

Примеры:

BamH I G*GATC C C CTAG*G

73 Тупые и липкие концы

Тупые и липкие концы

Липкие концы имеют выступающие одноцепочечные участки. При этом выступающие участки двух образующихся фрагментов комплементарны друг другу. могут образовываться липкие концы с 5‘ – выступающими нуклеотидами (например такие продукты образует эндонуклеаза рестрикции BamHI). и 3‘ – выступающие липкие концы, когда неспаренные нуклеотиды заканчиваются 3'-концом (например такие продукты образует эндонуклеаза рестрикции AatII). Тупые концы образуются, в случае, когда разрезание ДНК происходит строго по оси симметрии узнаваемой последовательности (пример эндонуклеазы рестрикции с такой специфичность — EcoRV).

74 Тупые и липкие концы

Тупые и липкие концы

GGA TCC

Липкие концы имеют выступающие одноцепочечные участки. При этом выступающие участки двух образующихся фрагментов комплементарны друг другу. могут образовываться липкие концы с 5‘ – выступающими нуклеотидами (например такие продукты образует эндонуклеаза рестрикции BamHI). и 3‘ – выступающие липкие концы, когда неспаренные нуклеотиды заканчиваются 3'-концом (например такие продукты образует эндонуклеаза рестрикции AatII). Тупые концы образуются, в случае, когда разрезание ДНК происходит строго по оси симметрии узнаваемой последовательности (пример эндонуклеазы рестрикции с такой специфичность — EcoRV).

75 Крупно- и мелкощепящие рестриктазы

Крупно- и мелкощепящие рестриктазы

Встречаемость тетра- и гексануклеотидов в ДНК.

Большинство рестриктаз II-класса узнают последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, поэтому рестриктазы делят на мелко- и крупнощепящие.

Cайт из четырех (тетра-) нуклеотидов встречаться в среднем 1 раз через каждые 256 пар оснований, а из шести (гекса-) нуклеотидов - через 4096 пар оснований.

Мелкощепящие рестриктазы узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Это связано с тем, что вероятность встречаемости определенной последовательности из четырех нуклеотидов гораздо выше, чем последовательности из шести нуклеотидов.

Например, в ДНК бактериофага Т7, состоящей из 40000 п. о., отсутствует последовательность, узнаваемая рестриктазой EcoR I. (G?AATTC)

К мелкощепящим относятся рестриктазы Hpa II и Alu (из Arthrobacter luteus), к крупнощепящим - EcoR I (из Escherichia coli) и Hind III.

76 Единицы активности рестриктазы

Единицы активности рестриктазы

– это количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК в реакционной смеси 50 мкл при оптимальных условиях (обычно при 37о С) за час.

Хранение

Рестриктазы хранятся при -20о С в буфере с 50% глицерина.

77 Рестрикционные карты

Рестрикционные карты

EcoR

EcoR

600bp

5’

3’

3’

5’

NcoI

BamH1

200bp

NcoI

BamH1

400bp

78 Задача на составление рестрикционных карт

Задача на составление рестрикционных карт

XhoI

NcoI

HindIII

NotI

200bp

400bp

200bp

200bp

200bp

1200bp

5’

3’

79 A

A

B

M

A

B

A+B

Задача на составление рестрикционных карт

5’

1200bp

300bp

300bp

700bp

600bp

500bp

600bp

HindIII

400bp

300bp

300bp

500bp

300bp

NcoI

200bp

200bp

200bp

HindIII

400bp

200bp

100bp

NcoI

400bp

200bp

200bp

3’

80 Задача на составление рестрикционных карт

Задача на составление рестрикционных карт

5’

PstI

262bp

762bp

PstI

500bp

3’

81 Спасибо за внимание

Спасибо за внимание

«Электрофорез ДНК в агарозном геле»
http://900igr.net/prezentacija/khimija/elektroforez-dnk-v-agaroznom-gele-255564.html
cсылка на страницу

Нуклеиновые кислоты

10 презентаций о нуклеиновых кислотах
Урок

Химия

65 тем
Слайды
900igr.net > Презентации по химии > Нуклеиновые кислоты > Электрофорез ДНК в агарозном геле